一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用，涉及分子生物学领域。一种用于木薯绵粉蚧分子生物学鉴定的靶标，所述靶标为单一序列的靶标或两条序列组成的靶标组合，单一序列的靶标的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，靶标组合的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.5所示。本发明专利技术提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法，通过荧光定量PCR进行鉴定，可提高检测结果的准确性，缩短检测时间。缩短检测时间。缩短检测时间。

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，尤其涉及一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用。

技术介绍

[0002]木薯绵粉蚧(Phenacoccus manihoti)，属半翅目(Hemiptera)、粉蚧科(Pseudococcidae)、绵粉蚧属(Phenacoccus)；木薯绵粉蚧的活体呈粉红色，身体表面被有一层白色蜡粉，体缘有明显短蜡突。体式显微镜下，该虫的雌成虫呈椭圆形。9节触角，18对刺孔群，每对刺孔群都有2个大锥刺。足发达，有爪齿，后足的基节无透明孔。三格腺散布，盘形腹脐。木薯绵粉蚧背刺小，刺基部无三格腺，该种与木薯绵粉蚧和扶桑绵粉蚧的主要区别在于后两种缺少五格腺。
[0003]木薯绵粉蚧的一龄若虫活动频繁，可从寄主植株上爬行至附近未被侵染的植株，也能随动物、风等扩散。木薯绵粉蚧体型较小，尤其在卵或一龄若虫阶段，肉眼难以直接观察。寡食性。目前木薯绵粉蚧可以确定的寄主植物有木薯、木薯橡胶、大豆和柑橘等，其中木薯绵粉蚧最常寄生的植物品种是木薯。木薯绵粉蚧会破坏木薯植株顶端的分生组织，严重时木薯的叶片全部脱落，嫩枝枯死及枝条畸形，造成木薯根的损失，最终导致整株死亡，影响木薯的产量。随着栽培技术及木薯品种选育技术的不断进步，木薯的种植面积不断扩大，绵粉蚧危害问题逐渐成为影响木薯产量的重要因素之一。
[0004]木薯绵粉蚧原产于南美洲中部，是当地木薯上的一种重要害虫，后随寄主植物及其产品传播扩散，陆续在西非、中非、东非发现，给非洲木薯产业造成巨大损失。2008年(或许更早)传入泰国，目前已在亚洲的泰国、老挝、柬埔寨、越南、印度尼西亚，非洲的安哥拉、贝宁、布隆迪、刚果、科特迪瓦、冈比亚、加纳、几内亚、几内亚比绍、肯尼亚、马拉维、莫桑比克、尼日利亚、卢旺达、塞内加尔、塞拉利昂、苏丹、坦赞尼亚、扎伊尔、中非共和国，南美洲的阿根廷、玻利维亚、巴西、哥伦比亚、巴拉圭、圭亚那等31个国家和地区严重发生，是威胁世界木薯生产安全的重大入侵害虫。经多方考证，目前我国尚未发现木薯绵粉蚧，然而，木薯绵粉蚧在我国广东、广西、海南等省的绝大部分地区以及福建、江西、贵州、云南等省份部分地区高度适生，在重庆、四川等部分地区中度适生。目前国际上用于木薯绵粉蚧鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定。因此，尽快研发木薯绵粉蚧快速检测技术，加强对木薯绵粉蚧的监测检测，是保障我国木薯及蔬菜花卉产业和水果、棉花产业健康发展的必要前提。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中的不足，本专利技术提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法及应用。
[0006]本专利技术提供了一种用于木薯绵粉蚧(Phenacoccus manihoti)分子生物学鉴定的靶标，所述靶标为单一序列的靶标或两条序列组成的靶标组合，单一序列的靶标的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，靶标组合的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.5所示。
[0007]本专利技术还提供了所述靶标在鉴定木薯绵粉蚧中的应用。
[0008]本专利技术还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的引物组合，
[0009]所述引物组合包括一条正向引物和一条反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
[0010]或者，所述引物组合包括两条正向引物和两条反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.7所示。
[0011]本专利技术还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的探针，
[0012]当使用上述中的引物组合，且引物组合包括一条正向引物和一条反向引物时，使用一条探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0013]当使用上述中的引物组合，且引物组合包括两条正向引物和两条反向引物时，使用两条探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.8所示。
[0014]使用两条探针时，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的探针，5
’
端标记的荧光基团是FAM，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ1；核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的探针，5
’
端标记的荧光基团是VIC，3
’
端标记的淬灭基团是BHQ1。
[0015]本专利技术还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的试剂盒，包括所述的引物组合，以及所述的探针。
[0016]本专利技术还提供了一种用于鉴定木薯绵粉蚧的方法，所述用于鉴定木薯绵粉蚧的方法为方法(A)或方法(B)：
[0017]所述方法(A)包括以下步骤：
[0018](a)提取待测样品的DNA作为扩增模板；
[0019](b)使用荧光定量PCR方法进行检测，检测使用的引物组合包括一条正向引物和一条反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；检测使用一条探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0020](c)若能够扩增得到明显荧光信号，说明待测样品含有木薯绵粉蚧；
[0021]所述方法(B)包括以下步骤：
[0022](1)提取待测样品的DNA作为扩增模板；
[0023](2)使用荧光定量PCR或数字PCR方法进行检测，检测使用的引物组合包括两条正向引物和两条反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.7所示；检测使用两条探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.8所示；
[0024](3)若两个荧光通道均能够扩增得到明显信号，说明待测样品含有木薯绵粉蚧。
[0025]所述荧光定量PCR反应体系为：II Probe qPCR SuperMix 10μL，引物组合中的引物各5pmol，探针各5pmol，模板1μL，用无菌无核酸酶水补足至20μL；扩增反应条件为95℃预变性30s；95℃变性10s，61.4℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。
[0026]所述数字PCR反应体系为：ddPCR Supermix for Probes 10μL，引物组合中的引物各18pmol，探针各5pmol，模板1μL，无菌无核酸酶水补至20μL；扩增反应条件为95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火&延伸60s，共45个循环；反应结束后保持4℃。
[0027]本专利技术基于木薯绵粉蚧高通量测序结果，筛选其基因组上多拷贝的特异性靶标序列，建立多通道荧光定量PCR检测方法，实现木薯绵粉蚧的快速鉴定。本专利技术的检测方法实
用性强、准确性高、特异性强、操作简单迅速，可满足相关部门针对检验检疫或害虫监测/检测的需要。
[0028]本专利技术的有益效果为：
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Supermix for Probes 10μL，引物组合中的引物各18pmol，探针各5pmol，模板1μL，无菌无核酸酶水补至20μL；扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志毅，张莉丽，季淑枫，范凌，黄芳，唐慧骥，党志浩，徐淼锋，赵丽，
申请(专利权)人：杭州市农业技术推广中心，
类型：发明
国别省市：