基于MALDI-TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的PCR引物、探针、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及生化检测技术领域，尤其涉及基于MALDI

【技术实现步骤摘要】
基于MALDI
‑
TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的PCR引物、探针、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及生化检测
，尤其涉及基于MALDI
‑
TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的PCR引物、探针、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]猪病毒性呼吸道疾病和繁殖障碍疾病是制约现代养猪业规模化和集约化发展的重要因素，不同猪呼吸道及繁殖障碍疾病在猪群间常出现混合感染和继发感染，并呈地方流行性发生，而其中80％以上的猪病为两种或两种以上病原体造成，例如猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2，PCV
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2)、猪圆环病毒3型(Porcine Circovirus 3，PCV
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3)、猪博卡病毒(Porcine Bocavirus，PBoV)和非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)等。PCV、PBoV可引起猪只呼吸系统疾病，PCV、PRV可导致猪只繁殖障碍性疾病的发生；而ASFV可导致猪只感染高度接触性传染病非洲猪瘟(African Swine Fever)，其强毒株致死率100％，且病原学和流行病学十分复杂。由于这些病原体导致的猪病发病机制与临床症状较为相像，给疫病防控带来较大阻碍，也使得多种病原体的高通量快速检测成为疫病防控的重点环节。
[0003]我国养猪市场巨大，据统计，我国生猪养殖量占世界生猪总养殖量的40％以上，生猪饲养产值接近1.3万亿。随着生猪养殖业规模化和集约化程度的提高，猪病混合感染的几率也随之增加。此外，近年来由于猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒等新发疫病在国内外流行范围的扩大以及非洲猪瘟等重大疫情的传播，加之部分病原体不同基因型病原体所引起的混合感染等，使得疫病防控难度进一步增大。此时若使用多种单目标检测方法对样本逐一进行检测，检测周期与成本都将大大增加，开发多目标高通量检测方法，提升检测诊断效率，将为疾病防控提供更强有力的保障。
[0004]目前动物疫病多重分子诊断技术主要以多重PCR方法、多重TaqMan或SYBR Green荧光定量RT
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PCR方法及GeXP多重PCR技术为主，如本申请的申请人申请的中国专利技术专利(公开号：CN105936944A，公开日：20160914)公开了一种针对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒H1亚型的三重荧光RT
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PCR检测试剂盒及引物、探针，该方法实现在猪中对上述3种病原的快速早期鉴别诊断，由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期鉴别检测效率，并简化了检测方法。申请人申请的中国专利技术专利(公开号：CN113322352A，公开日：20210831)公开了一种三重数字微滴PCR检测猪圆环病毒的方法、引物、探针和试剂盒，该方法基于ddPCR的优势，建立猪圆环病毒不同基因型的高灵敏、精确鉴别检测方法，可应用于常规动物检疫以及饲料、肉制品、疫苗等病毒含量低、基质复杂的动物源产制品的检疫监测和载量滴定。多重PCR方法的敏感性及特异性相较荧光方法较低，且退火温度容易受到扩增片段长度的影响；荧光定量的检测方法虽然具有高度的特异性和敏感性，检测时间短，但存在荧光通道的限制及多重引物间的交叉反应性，极大地限制了多重荧光定量PCR方法同时检测四重及以上的靶标的能力；GeXP多重RT
‑
PCR技术则由于毛细管电泳灵敏度过
高，可能造成检测结果假阳性。
[0005]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
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TOF MS)是一种新型生物大分子检测技术，它将生物大分子与基质分子结合生成共结晶，在激光轰击后根据质荷比对分析样本进行区分和检测。即通过与多重PCR联用，针对扩增后的多靶标核酸片段，分别设计对应的延伸探针(UEP)进行单碱基延伸，延伸后的产物经MALDI
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TOF MS分析检测，得到不同特异性核酸片段的质量信号，从而对同一样本进行多靶标同步鉴别检测。MALDI
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TOF MS技术最多一次可同时对2
×
386个样本进行多目标检测，每个反应最多可检测40个靶目标，大大提高了检测鉴定的效率。
[0006]MALDI
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TOF MS在病原微生物的临床检测中已有较多应用，并在病原体高通量检测及分型诊断中展现出良好的前景。Liu等人建立了可以同时检测和区分7种人类冠状病毒(HCoV)的核酸质谱检测方法，检测限为1
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5个拷贝/反应，为HCoV的大规模筛查提供了技术平台；刘宏钱等人建立了人呼吸道症候群相关病毒MALDI
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TOF MS多目标检测技术，可同时对27种呼吸道病原体进行检测，灵敏度达10～1000拷贝/μL。在动物疫病诊断方面，Liu等人建立了10种鸭源性致病病毒的MALDI
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TOF MS同步检测方法，体系的最低检测限均可达10拷贝/μL。但是，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
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TOF MS)在猪多种病原体的高通量快速检测，目前还没有公开报道。

技术实现思路

[0007]为了解决上述的技术问题，本专利技术针对PRV、PCV
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2、PCV
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3、PBoV
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G1、PBoV
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G2、PBoV
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G3和ASFV等常见的猪呼吸道DNA病毒设计多重引物及UEP探针，建立了能同步鉴定7种常见猪呼吸道病毒的MALDI
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TOF MS高通量多目标技术体系，为猪群相关疫病监测和鉴别诊断以及进出口动物检疫提供了一种新的高效手段。
[0008]为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：
[0009]一种基于MALDI
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TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的PCR引物和探针，所述七种猪呼吸道病毒为猪伪狂犬病毒PRV、猪圆环病毒2型PCV
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2、猪圆环病毒3型PCV
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3、猪博卡病毒1型PBoV
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G1、猪博卡病毒2型PBoV
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G2、猪博卡病毒3型PBoV
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G3和非洲猪瘟病毒ASFV，其中：
[0010]猪伪狂犬病毒PRV的PCR引物的序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.15所示；
[0011]猪圆环病毒2型PCV
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2的PCR引物的序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.16所示；
[0012]猪圆环病毒3型PCV
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3的PCR引物的序列为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于MALDI
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TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的PCR引物和探针，所述七种猪呼吸道病毒为猪伪狂犬病毒PRV、猪圆环病毒2型PCV
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2、猪圆环病毒3型PCV
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3、猪博卡病毒1型PBoV
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G1、猪博卡病毒2型PBoV
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G2、猪博卡病毒3型PBoV
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G3和非洲猪瘟病毒ASFV，其特征在于，猪伪狂犬病毒PRV的PCR引物的序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.15所示；猪圆环病毒2型PCV
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2的PCR引物的序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.16所示；猪圆环病毒3型PCV
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3的PCR引物的序列为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.17所示；猪博卡病毒1型PBoV
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G1的PCR引物的序列为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.18所示；猪博卡病毒2型PBoV
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G2的PCR引物的序列为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.19所示；猪博卡病毒3型PBoV
‑
G3的PCR引物的序列为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.20所示；非洲猪瘟病毒ASFV的引物PCR序列为SEQ ID No.13、SEQ ID No.14所示，UEP延伸探针的引物序列为SEQ ID No.21所示。2.根据权利要求1所述的PCR引物和探针，其特征在于，SEQ ID No.1
‑ꢀ
SEQ ID No.14所示的每条PCR引物的５
′
端加入10个碱基的Tag，Tag的序列为ACGTTGGATG。3.一种基于MALDI
‑
TOF质谱检测七种猪呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的PCR引物和探针。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括进行反转录和PCR反应所需的试剂。5.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于， PCR引物的浓度为0.5
‑
0.7μM，UEP延伸探针的浓度为3.5
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6.5μM；优选，猪伪狂犬病毒PRV的PCR引物的浓度为0.6 μM，猪圆环病毒2型PCV
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2的PCR引物的浓度为0.7μM、猪圆环病毒3型PCV
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3的PCR引物的浓度为0.7μM、猪博卡病毒1型PBoV
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G1的PCR引物的浓度为0.6 μM、猪博卡病毒2型PBoV
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G2的PCR引物的浓度为0.6 μM、猪博卡病毒3型PBoV
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G3的PCR引物的浓度为0.5 μM，非洲猪瘟病毒ASFV的PCR引物的浓度为0.5 μM；猪伪狂犬病毒PRV的延伸探针的浓度为6 μM，猪圆环病毒2型PCV
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2的延伸探针的浓度为5 μM、猪圆环病毒3型PCV
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3的延伸探针的浓度为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓峰，帅江冰，曾若雪，莫虹斐，金晨晨，黄康东，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：