一种快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR方法，属于病毒PCR检测技术领域。本发明专利技术所提供的PCR方法首先设计合成引物和探针，然后获取待测样品DNA模板，最后配制TaqMan PCR反应体系进行PCR反应。该PCR方法具有高灵敏度和特异性强的特点，其最低检测限可达到1 copy/μL。copy/μL。copy/μL。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR方法


[0001]本专利技术属于病毒PCR检测
，尤其涉及一种快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。

技术介绍

[0002]目前，中国对虾养殖产量居全球首位，但随着高密度集约化养殖的推广，对虾病毒性疾病频繁暴发，因缺乏全面有效的预防措施和靶向药物，已成为对虾养殖过程中威胁性最大的疾病，给对虾养殖户造成了巨大损失，严重阻碍了对虾养殖产业的发展。
[0003]对虾虹彩病毒病作为一种于近年发现的高致死性病毒病，其病原为对虾血细胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV），SHIV是一种以线性双链DNA为遗传物质的二十面体对称型病毒，可感染所有生长阶段的虾，SHIV感染会导致对虾行动缓慢且活力急剧下降，人工感染实验表明SHIV可致健康对虾在感染后15天内全部死亡。而SHIV感染引起的对虾空肠空胃及肝胰腺发白的症状也存在于其它病毒性疾病中，因此，亟需建立一种快速、准确、灵敏和特异的SHIV检测方法，以此实现养殖过程中的病毒现场检测和疫病监控，助力对虾健康养殖。
[0004]为满足对虾养殖产业中对SHIV的防控需求，目前已建立了多种关于SHIV的检测方法，主要包括组织病理学方法和分子生物学方法两大类。组织病理学方法中最常用的组织病理切片技术主要包括切片组织的固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色及封片观察等步骤，制作完成的组织病理切片可在光学显微镜下进行观察，感染SHIV的病料样本切片中可观察到嗜碱性包含体的存在及核固缩现象，而健康对虾样本中没有。以环介导等温扩增（LAMP）技术、套式PCR（Nested PCR）技术、等温重组酶聚合酶（RPA）技术和实时荧光定量PCR（RT
‑
PCR）技术为代表的分子诊断技术以特异性引物识别病原核酸，受样品种类限制少，具有快速、灵敏、损伤小、可定性、可量化、操作简便及试剂无毒性的特点，大幅提高了SHIV诊断的时效性和精准性，未来具有良好的发展潜力。
[0005]然而，上述方法在对虾产业应用过程中均存在一定局限性。组织病理观察所需操作步骤较为繁琐、耗时久（全过程约需2
‑
3天）、损伤大、技术难度较高、不能一次性确诊且试剂对人体有一定毒性。与组织病理学方法相比，分子生物学技术具有操作便捷、可定性定量、毒性低的优势，但其敏感性仍存在一定的提升空间，其中定量实时环介导等温扩增（qLAMP）技术最低只能检测到1.9
×
10
1 copies/mL，套式PCR最低能检测到1.42
×
10
1 copies/mL，等温重组酶聚合酶扩增（RPA）技术的最低检测限也仅为7 copies/μL。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种具有高灵敏度的快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
本专利技术提供了一组用于快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR的引物和探针，所述引物的序列和探针的序列如下所示：SHIV
‑
F：ACGGGAAAACGGTAACTCAAA；SHIV
‑
R：CTGCCCATCTAACACCATCTC；SHIV
‑
P：FAM
‑
CGAATTGGCCAGGGCG
‑
MGB。
[0008]其次，本专利技术提供了一种用于快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有检测SHIV病毒的引物和探针，所述引物和探针的序列如下：SHIV
‑
F：ACGGGAAAACGGTAACTCAAA；SHIV
‑
R：CTGCCCATCTAACACCATCTC；SHIV
‑
P：FAM
‑
CGAATTGGCCAGGGCG
‑
MGB。
[0009]优选地，所述试剂盒还含有2
×
qRT
‑
PCR Mix，无DNA酶水。
[0010]优选地，所述试剂盒的反应体系为：2
ꢀ×ꢀ
qRT
‑
PCR Mix 12.5 μL，SHIV
‑
F 0.5 μL，SHIV
‑
R 0.5 μL，SHIV
‑
P 0.5 μL，无DNA酶水6 μL，待测样品DNA模板 5 μL。
[0011]优选地，所述试剂盒的反应条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，变性与退火延伸过程共40个循环。
[0012]其次，本专利技术提供了一种快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,所述方法包括如下步骤：（1）获取待测样品DNA模板；（2）配制TaqMan PCR反应体系进行PCR反应，所涉及引物和探针的序列如下：SHIV
‑
F：ACGGGAAAACGGTAACTCAAA；SHIV
‑
R：CTGCCCATCTAACACCATCTC；SHIV
‑
P：FAM
‑
CGAATTGGCCAGGGCG
‑
MGB；（3）根据PCR反应检测结果进行判定。
[0013]优选地，所述TaqMan PCR反应体系为2
ꢀ×ꢀ
qRT
‑
PCR Mix 12.5 μL，SHIV
‑
F0.5 μL，SHIV
‑
R 0.5 μL，SHIV
‑
P 0.5 μL，无DNA酶水6 μL，待测样品DNA模板 5 μL。
[0014]优选地，所述PCR反应的条件为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，变性与退火延伸过程共40个循环。
[0015]本专利技术的有益效果是：1. 快速便捷：本专利技术所涉及检测方法反应体系中的2
ꢀ×ꢀ
qRT
‑
PCR Mix、SHIV
‑
F、SHIV
‑
R、SHIV
‑
P及无DNA酶水五种组分可提前混合为预混液，如此在检测时仅需向反应管中添加预混液和样品DNA两种组分，操作简便；且检测迅速，反应时间仅需40 min。
[0016]2. 灵敏度高：本专利技术对SHIV ATPase基因的检测限可低至1 copy/μL，阳性样品检出率高。
[0017]3. 特异性强：本专利技术所涉及引物和探针根据SHIV ATPase保守区域三段不同序列设计，只有SHIV
‑
F、SHIV
‑
R和SHIV
‑
P同时与样品DNA结合，体系内荧光强度才会增强，出现S型扩增曲线；同时，反应体系中的热启本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于，所述引物的序列和探针的序列如下所示：SHIV
‑
F：ACGGGAAAACGGTAACTCAAA；SHIV
‑
R：CTGCCCATCTAACACCATCTC；SHIV
‑
P：FAM
‑
CGAATTGGCCAGGGCG
‑
MGB。2.一种用于快速检测对虾血细胞虹彩病毒的TaqMan荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有检测SHIV病毒的引物和探针，所述引物和探针的序列如下：SHIV
‑
F：ACGGGAAAACGGTAACTCAAA；SHIV
‑
R：CTGCCCATCTAACACCATCTC；SHIV
‑
P：FAM
‑
CGAATTGGCCAGGGCG
‑
MGB。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有2
×
qRT
‑
PCR Mix，无DNA酶水。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：2
ꢀ×ꢀ
qRT
‑
PCR Mix 12.5 μL，SHIV
‑
F 0.5 μL，SHIV
‑
R 0.5 μL，SHIV
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：秦立廷，刘佳裕，陈婷，李晓菲，车路平，
申请(专利权)人：山东新希望六和集团有限公司新希望六和股份有限公司，
类型：发明
国别省市：