【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体地说，尤其涉及尼帕病毒微滴数字pcr检测方法，具体涉及到饲料、动物组织和动物源产制品等尼帕病毒含量较低或基质复杂样品的监测和定量检测方法。
技术介绍
1、尼帕病毒(nipah virus，niv)属于副粘病毒科(paramyxoviridae)亨尼帕病毒属(henipavirus)，是一种具有囊膜的单股负链rna球形病毒，大小约150nm，基因组全长约18.2kb，为人兽共患的自然疫源性疾病，具有宿主范围广、传播途径多、传播能力强及致死率高等特点。niv主要由狐蝠属果蝠传播，能够感染包括人在内的多种哺乳动物，如猪、马、牛、羊、豚鼠等，猪感染niv后表现为呼吸急促，发展为呼吸困难并伴随非自主性咳嗽，死亡率在5％左右。2018年世界卫生组织将尼帕病毒病(nipahvirus disease，nvd)列为对公共卫生造成严重威胁的有限疾病名单，2022年我国农业农村部发布第573号公告，对原《一、二、三类动物疫病病种名录》进行了修订，将尼帕病毒纳入一类动物疫病。
2、niv首次发现于1998年马来西亚，20年间造成265人发病、105人死亡，导致了100万头生猪被扑杀，经济损失超过5万亿美元，近年来仍不断发现有niv病毒感染情况。2001年起，niv感染疫情在孟加拉国发生，此后几乎每年都有疫情报道，同年，niv感染疫情开始在印度暴发，2018年南部地区的病死率高达91％，超过2000人接受医学观察，开始出现“蝠传人”、“人传人”现象。研究表明，niv的传播能跨越物种障碍，可通过病毒溢出的方式感染人
3、niv rna分别编码融合糖蛋白(f)、附着糖蛋白(g)、基质蛋白(m)、核衣壳蛋白(n)、长聚合酶(l)以及磷蛋白(p)6种结构蛋白。n蛋白为典型的螺旋或人字形结构，通常用于识别副粘病毒科家族的病毒，还参与病毒rna的转录和复制等过程。n基因能进行高效表达且具有高度的保守性，将其用于niv感染的诊断和流行病学调查具有较高的可行性。已有研究表明在自然感染的血清中niv n蛋白抗原表位刺激机体所产生的抗体占优势，可代替全病毒作为检测抗原进行酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)检测；由n基因以原核表达的n蛋白与阳性血清在血清学上出现交叉反应；在oie《陆生手册》以及国境口岸行业标准中均采用n基因作为核酸检测方法的目的基因，均说明对于n蛋白的氨基酸和基因序列在niv的疫苗的研制以及实验室检验研究等方面具有重要意义。
4、niv与猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪伪狂犬等病毒引起的症状相似，临床上难以鉴别，实验室检测是目前最有效的监控方法。由于尼帕病毒为一类疫病，当前尚无用于防控疫苗、药物，分离培养病原操作要求生物安全四级实验室(bsl-4)条件，一般实验室不具备处理条件，但对于病毒核酸的检测无需活病毒样本，可在bsl-2实验室进行，不易发生生物安全事故，荧光pcr(qpcr)检测niv是目前实验室检测中常用的检测方法，并被应用于试剂盒中。
5、中国专利技术专利(公开号：cn116064937a，公开日：2023.05.05)公开了一种基于数字pcr技术的病毒联合检测试剂盒。该专利技术的原理是基于荧光探针法，针对靶基因设计特异性引物探针，检测5种病毒基因。该专利技术利用多重数字pcr体系解决同时检测一例样本中是否含h7n9病毒、狂犬病毒、汉坦病毒、尼帕病毒、流行性乙型脑炎病毒可检测到终浓度为100iu/ml的病毒核酸，灵敏度高。
6、中国专利技术专利(公开号：cn112501351b，公开日：2023.07.21)公开了一种尼帕病毒taqman探针荧光定量pcr试剂盒及其应用，其中包含的引物和探针序列如下：正向引物niv-qf:5’-tctcccagagtctatcagtaagg-3’；反向引物niv-qr:5’-ccataccagtttcctcgacatag-3’；探针niv-probe:fam-5’-aggatctgctaaaggcagagcagt-3’-bhq1。该专利技术还提供了运用上述试剂的体外荧光pcr检测尼帕病毒的方法，可以快速准确地检测尼帕病毒。该专利技术建立的尼帕病毒荧光pcr检测方法具有操作简便，高效、快速、特异的优点；该方法的建立，对样本的检测只需2小时左右即可完成，灵敏度可以达到14.8copies/μl，填补了国内检测尼帕病毒的空白。
7、但是，qpcr在复杂基质样品、加工产品以及病毒载量较低的样品应用中难以满足检测较少量病毒拷贝浓度的需求。随着进出口贸易市场的不断扩大，niv传播途经的不断变化，我国口岸防控niv形势十分严峻，给niv病毒监测提出了新的挑战，对于进出口境中检测一些复杂基质样品或一些病毒载量少的样品，qpcr还存在有局限性。微滴数字pcr(digitaldroplet pcr，ddpcr)是继qpcr后出现的第三代pcr核酸检测方法，其通过油包水液化微滴，将20μlpcr体系分布于独立的微滴中，随后通过统计分析阳性微滴数计算出体系中目标核酸的初始拷贝数，对样品中病毒含量进行直接定量，具有高灵敏度，强抗干扰性以及绝对定量等优点。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术的不足，建立了尼帕病毒微滴数字pcr检测方法，根据niv n靶基因，建立了niv的ddpcr定量检测方法，为病毒载量较低或基质复杂样品的niv早期识别和定量监测提供一种新的、科学的检测方法。
2、为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：尼帕病毒n基因靶标在制备尼帕病毒检测试剂中应用，所述尼帕病毒n基因靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。通过该尼帕病毒n基因靶标设计的特异性引物及探针可以提供尼帕病毒微滴数字pcr检测方法。
3、进一步，本专利技术还提供了一种检测所述的尼帕病毒n基因靶标的特异性引物及探针；优选，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：
4、niv-fp：ctaaaggcagagcagtag；
5、niv-rp：gataccttgtctccaacc；
6、niv-probe-fam：fam-tggcaggattcttcgcaaccatca-bhq1。
7、进一步，本专利技术还提供了一种包含所述特异性引物及探针的试剂盒。
8、作为优选，所述特异性引物浓度为700nmol/l，探针浓度为100nmol/l。
9、作为优选，该试剂盒包括：supermix 5.0μl，reverse transcriptase 2.0μl，300mm dtt 1.0μl，引物1.4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.尼帕病毒N基因靶标在制备尼帕病毒检测试剂中应用，其特征在于，所述尼帕病毒N基因靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种检测权利要求1所述的尼帕病毒N基因靶标的特异性引物及探针。
3.根据权利要求2所述的特异性引物及探针，其特征在于，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：
4.一种包含权利要求2或3所述特异性引物及探针的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，特异性引物浓度为700 nmol/L，探针浓度为100 nmol/L。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：Supermix 5.0 μL，Reverse transcriptase 2.0 μL，300 mM DTT 1.0 μL，引物1.4 μL，探针0.2 μL，ddH2O8.0 μL，模板 1.0 μL。
7.根据权利要求2或3所述特异性引物及探针或权利要求4或5或6所述试剂盒在尼帕病毒非疾病诊断方法中应用，尤其是饲料、动物组织和动物源产制品检测中的应用。
8.尼帕病毒微滴数字
9.根据权利要求9所述的尼帕病毒微滴数字PCR检测方法，其特征在于，ddPCR检测的反应条件：50 ℃ 20min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，40个循环；98 ℃ 10 min；4 ℃ Hold；反应升降温速率均为2 ℃/s。
10.根据权利要求9所述的尼帕病毒微滴数字PCR检测方法，其特征在于，检测方法适用于饲料、动物组织和动物源产制品检测。
...【技术特征摘要】
1.尼帕病毒n基因靶标在制备尼帕病毒检测试剂中应用，其特征在于，所述尼帕病毒n基因靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种检测权利要求1所述的尼帕病毒n基因靶标的特异性引物及探针。
3.根据权利要求2所述的特异性引物及探针，其特征在于，所述特异性引物及探针的核苷酸序列如下：
4.一种包含权利要求2或3所述特异性引物及探针的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，特异性引物浓度为700 nmol/l，探针浓度为100 nmol/l。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：supermix 5.0 μl，reverse transcriptase 2.0 μl，300 mm dtt 1.0 μl，引物1.4 μl，探针0....
【专利技术属性】
技术研发人员：帅江冰，张晓峰，裘慧，曾若雪，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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