一种抗猪瘟病毒的肽核酸制造技术

本发明专利技术提供了一种抗猪瘟病毒的肽核酸，所说的肽核酸为针对抗猪瘟病毒的C蛋白和/或Npro蛋白的反义核酸序列。本发明专利技术还提供了含有所述的抗猪瘟病毒的肽核酸的药物组合物。本发明专利技术还提供了所述的抗猪瘟病毒在制备动物药物上的用途。本发明专利技术的用于防控猪瘟病毒CSFV的特异性抗病毒肽核酸动物药物，是针对CSFVC和Npro的基因保守部分设计高效特异性的反义核酸序列，并采用特定工艺人工合成肽核酸片段，该序列与上述保守性靶基因互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与CSFVC和Npro的对应的靶基因相结合，诱导核酶对靶基因进行降解，从而阻断靶基因的转录与表达，抑制CSFV在机体内复制与装配，以达到防控猪瘟的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种抗猪瘟病毒的肽核酸。
技术介绍
猪痕(HogCholera, HC),又称之为经典猪痕(Classical Swine Fever, CSF),不同于非洲猪瘟，系由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病。猪瘟最早于19世纪30年代在美国的俄亥俄州发现，是一种接触性传染，流行广、死亡率高的猪的传染病。猪瘟造成的经济损失巨大，历来是各国研究的热点，国际兽医局(OIE)国际委员会将猪瘟列入A类16种法定传染病之一。 我国是世界上养猪最多的国家，也是猪瘟流行严重的国家之一，我国近几年因各种疾病死亡的猪占饲养总数的8% 10%，其中1/3以上由猪瘟致死，每年的直接经济损失数十亿元，造成了巨大的人力和资源浪费。间接影响如猪群中存在猪瘟时主要国际市场都禁止进口其活猪和猪肉。根据发病的程度，将其分为急性、亚急性、慢性、非典型性和不明显型。急性CSF由强毒株引发，一般导致高发病率和死亡率，而弱毒病毒感染则无明显临床症状。介于疫苗的广泛应用，有效地控制了猪瘟的大流行，减少了急性死亡。但自上世纪70年代末以来，全世界猪瘟流行的特点均发生了重大变化，如临床症状不典型，病程变长，呈周期性、波浪形的地区散发性流行，持续感染普遍存在，疫苗的预防效果明显下降。同时疫点明显减少，多局限于所谓的“猪瘟的不稳定地区”的散发性流行。近年来，国内又出现猪瘟的反弹现象，而且疫情变得异常复杂，如既有区域性大流行又有零散式发生，既有高死亡率的急性症状，又有顽固的持续发生的温和性症状。目前世界各国针对CSF疫情的处理主要有两种手段:1，扑杀，建立完善且严格的疫情监测与报告体系，及时发现、划定及封锁疫区、采取彻底扑杀所有感染猪群与感染动物并进行无害化处理和彻底消毒环境，消灭传染源；2，免疫，强化以猪瘟病毒(CSFV)疫苗接种为主要手段。中国猪瘟兔化弱毒(C2株)疫苗自从问世以来，一直享誉海内外，被许多国家竟相引用。自从二十世纪60年代以来，C2株疫苗及其换代产品(细胞苗)在我国以防为主的猪瘟防治策略的实施中起到了决定性的作用，有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但自20世纪80年代以来，非典型性猪瘟成为该病的主要发生形式，持续感染普遍存在，疫苗的预防效果明显下降，使猪瘟防制遇到了新的困难。经流行病学调研发现近年来猪瘟流行毒已呈远向疫苗毒的方向演变，近期猪瘟流行毒与古典猪瘟毒之间有较大差异(核酸和氨基酸同源性分别为82.2% 84.3%和87.9% 90.4%)。猪痕病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)痕病毒属。病毒颗粒呈圆形,直径为40 -50 nm,有囊膜,病毒表面有6 nm 8 nm类似穗样的突起，内部为二十面体的对称核衣壳，内部核心直径大约30 nm，猪瘟病毒不耐热，pH5 10时稳定，不耐酸(如<pH3.0)，对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐等脂溶剂敏感，可很快使病毒失活。参考猪瘟流行毒株的序列，该病毒可分为三个群=CSFV-1,称为古典猪瘟，以Brescia株为代表。CSFV-2，以Alfort株为代表。CSFV-3，与上述二个群均有较大差异，包括了一些日本、泰国和台湾地区近年来流行毒株。中国流行的优势毒株多属CSFV-2。CSFV基因组为单股线性正链RNA分子，基因组大约12.5 kb,由5’非编码区(5’ -UTR)、一个开放阅读框(ORF)和3’-非编码区(3’-UTR)构成。其5'端无甲基化帽子结构，3'端也无poly (A)尾巴结构。5'端UTR长度为373 nt或374 nt，有茎环，发夹等复杂二级结构，其5'端没有帽子结构，因而翻译起始机制与一般真核生物的mRNA分子不同，是由5'端UTR内有一个称为核糖体内部进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)的结构元件与核糖体40S亚基结合，启动蛋白质的翻译。5'端UTR不仅与翻译有关，与病毒基因组的复制也有关。3’端长度215 nt 239 nt，随毒株不同而有差异。在所有瘟病毒中3'端是高度保守的，特别是最后大约100 nt的区域。3'端在病毒的复制繁殖过程中有重要作用，它参与病毒基因组的复制、多聚蛋白的翻译和病毒粒子的装配。中间的ORF编码一个3898个氨基酸的多聚蛋白，分子量约438 kDa的多聚蛋白(NpM、C、Ems (E0),EUE2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，并进一步在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为成熟蛋白，CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码。蛋白及其功能 C蛋白为猪瘟病毒的核衣壳蛋白，为结构蛋白，由86 89个氨基酸残基组成，分子质量14 kDa，又被称之为pl4，该蛋白的N端为Serl9。C蛋白富含碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)，带正电荷。C蛋白除构成病毒的核衣壳外，同时在病毒增殖过程中对基因表达调控发挥着重要的作用。研究表明，该蛋白179 180、194 198、208 212氨基酸的突变将显著降低病毒的增殖能力。C蛋白主要分布在细胞核和细胞浆中，这可能与C蛋白参与病毒复制和转录调控有关，但其具体作用机制还需深入研究。另有研究表明，重组表达的C蛋白可激活人HSP70基因的启动子，但对SV40启动子具有抑制作用，这也证明了 C蛋白对基因表达有调节作用，而且对不同的启动子有截然相反的调控作用。pro蛋白及其功能 Npro蛋白，也称p23，为猪瘟病毒编码的非结构蛋白，分子量为23kDa，处于ORF编码的多聚蛋白N端的第一位，由168个氨基酸残基组成，是一种具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶，其具有在自身C端剪切产生病毒核衣壳蛋白的N端的功能，是病毒在细胞内增殖所必需的构件，当它缺失后，从培养物中分离不到存活的病毒。研究表明Npix)有助于CSFV逃避机体的自然免疫，建立持续性感染。Xu等通过基因沉默技术，干扰Npix)表达可有效抑制CSFV在PK-15细胞中的繁殖。Wen等以家兔为模型，发现家兔感染CSFV后，干扰Npro表达同样可以能有效抑制猪瘟病毒的增殖。Ruggli等研究表明，Npix)能抑制机体的天然免疫系统，使病毒逃避宿主的免疫清除，因此，Npro实可能与猪瘟病毒的毒力及致病性有关。反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与革E基因(mRNA或DNA)的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在复制、转录和翻译水平调节靶基因的表达，或诱导RNase H识别并切割mRNA，进而使其功能丧失。反义核酸包括反义RNA (antisense RNA)和反义DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物，掀起了一场药理学领域的革命，即新的药物受体mRNA通过新受体结合方式(Watson-Crick杂交)、引发新的药物受体结合后反应:(I) RNase H介导的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸(ODNs)疗法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗猪瘟病毒的肽核酸，其特征在于，所说的肽核酸为针对抗猪瘟病毒的C蛋白和/或Npro蛋白的反义核酸序列，所述的针对C蛋白的反义核酸序列选自SEQ?ID.1、SEQ?ID.2和SEQ?ID.3核苷酸序列中的一种或一种以上；所述的针对Npro蛋白的反义核酸序列选自SEQ?ID.4、SEQ?ID.5和SEQ?ID.6核苷酸序列中的一种或一种以上。

【技术特征摘要】
1.一种抗猪瘟病毒的肽核酸，其特征在于，所说的肽核酸为针对抗猪瘟病毒的C蛋白和/或Npn5蛋白的反义核酸序列，所述的针对C蛋白的反义核酸序列选自SEQ ID.1、SEQID.2和SEQ ID.3核苷酸序列中的一种或一种以上；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩健宝，曲向阳，顾宏伟，王远孝，马国辅，
申请(专利权)人：韩健宝，
类型：发明
国别省市：