本发明专利技术涉及一种靶向MITF基因的双链siRNA分子及其在美白祛斑化妆品或制备治疗黑色素基因相关疾病药物中的应用。该siRNA分子正义链为SEQIDNO:3，反义链为SEQIDNO:4，其中，反义链可特异性地与MITF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到降低黑色素的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种siRNA分子及其应用，尤其是抑制黑色素生成的siRNA分子及其应用。
技术介绍
小眼 畸形相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscription factor,MITF)，又称小眼球相关转录因子，在黑色素细胞的发育、分化和功能调节上起着重要作用。MITF具有基本-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic-helix-loop-helix-leucine zipper,bHLHZip)结构(Hodgkinson CA 等，1993, Cell, 744:395_404)。人类的 MITF 基因定位于人类第三条染色体3P141-3P12 3。研究证实其在色素细胞的发育、分化和功能调节中发挥关键性作用。MITF基因突变导致色素细胞的发育缺陷与功能障碍，同时MITF与其他信号分子发生复杂的相互作用。MITF可调控酪氨酸基因家族的表达，从而参与黑素生成的调控(Shibahara，S等，Pigment Cell Res，1998，11:329_336)。酪氨酸酶基因家族的三个成员:酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1 (TRP-1)，酪氨酸酶相关蛋白-2 (TRP-2)，基因的启动子都含有一个“M box”的结构，M box的核心结构为“CATGTG”，MITF可以与该结构结合，从而反式激活相应的基因表达。MITF通过与酪氨酸酶基因家族启动子的作用，一方面指导它们在黑素细胞中特异性表达，另一方面参与外界刺激对黑素细胞黑素生成的调控。根据人酪氨酸基因缺失和突变分析，发现在酪氨酸启动子有三个结构:TDE、M box和E box，这三个结构均含有“CATGTG”核心模色，它们对于酪氨酸在色素细胞中有效表达是必须的，而在非色素细胞中具有同样结构的启动子仅有微弱表达，进一步研究发现MITF与这些结构结合，刺激启动子的转录活性。MITF本身也具有细胞特异性，MITF在酪氨酸酶的黑素细胞特异性表达中起着关键作用。TRP-1和TRP-2也具有M-box结构，该结构在酪氨酸家族高度保守，MITF可与TRP-1基因M-box结合而活化其表达，并指导其在黑素细胞中特异性表达。(Aksan I等，Mol CellBiol,1998，18(12):6930_8)。黑色素细胞是皮肤的重要组成细胞之一，起源于胚胎神经嵴，具有树状突起，属于腺细胞，合成的黑素经由树状突起分泌进入角质形成细胞，随角质形成细胞的脱落而排出体外，存在于表皮基底层。黑色素细胞通过合成黑色素形成皮肤颜色，同时可吸收紫外线，使机体免遭紫外线的损害。哺乳动物皮肤和毛发的颜色主要是由黑色素细胞产生的黑色素的相对数量和分布情况决定的(Sturm RA等，Bioessays, 1998, 20:712)0黑色素又分为真黑色素(Eu-melanin)(棕/黑)和假黑色素(Pheo-melanin)(红/黄色)(Newton JM等,Mamma Genome, 2000,11:24)。黑色素细胞的发育、分化与黑色素的合成调节是一个复杂的过程，其中有多种信号分子参与该过程的调控，构成复杂的信号网络，其中MITF在其中扮演重要的角色。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物界中一种既古老且在进化上又高度保守的现象，是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的基因转录后沉默(Andrew Fire 等，Nature，1998，391:806_811)。小干扰 RNA (siRNA)是RNAi的效应分子，由两条互补的RNA单链构成，长2广23个核苷酸(nt)。由于RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以技术广泛地应用于功能基因组学研究、传染性疾病以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。有研究报道，通过RNAi调节抑制MITF基因，可以调控下游酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和酪氨酸酶相关蛋白I (tyrosinase relatedprotein-1，TRP-1)基因(Busca B 等，J Cell Biol，2005，49)，从而调控黑色素的生成。
技术实现思路
本专利技术的 目的在于提供一种通过siRNA分子库技术筛选出的高效靶向MITF基因的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成: 正义链:5’-GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’ (SEQ ID NO: 3) 反义链:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-3’ (SEQ ID NO: 4) 其中，N为胞嘧啶核苷C、鸟嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脱氧胞嘧啶核苷dC、脱氧鸟嘌呤核苷dG、脱氧腺嘌呤核苷dA或脱氧胸腺嘧啶核苷dT。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为: 正义链:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGA-3’(SEQ ID NO: 5) 反义链:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCC-3’(SEQ ID NO: 6) 在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本专利技术的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备美白祛斑化妆品和治疗高黑色素相关疾病药物中的应用。本专利技术针对参与黑色素形成调控的MITF基因的构建siRNA分子库，通过高通量筛选的方法筛选出能有效抑制黑色素生成的siRNA，通过RNAi调节抑制MITF基因，从而调控黑色素的生成。本专利技术筛选到的靶向MITF基因的siRNA可以作为药物制剂或化妆品的一种有效成份，用于下调皮肤中黑色素基因的表达，以减少色素的含量和沉着，祛除皮肤上的斑点，如老年斑、痘印、色素斑、雀斑、妊娠斑或其它由阳光、炎症、药物等因素引起的色素变化，从而使人体肌肤变白。体外实验证明，本专利技术的SiRNA分子的反义链可特异性地与MITF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，下调黑色素相关基因的表达，最终抑制黑色素的生成，无明显毒副作用。附图说明图1是合成的MITF基因保守区开放阅读框琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA片段大小为1563bp。左侧条带是DNA分子量Marker (标准参照)。图2是siRNA分子库构建流程示意图。图3是“U6_siRNA转录模板-H1”表达框结构示意图。图4是PCR制备的“U6_siRNA转录模板-H1”表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图(部分)。图中，最右侧条带是DNA分子量Marker (标准参照)。图5是“U6_siRNA转录模板-H1”表达框转染细胞后实时定量PCR检测MITF基因的mRNA表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组,纵坐标表示MITF相对于GAPDH的mRNA表达水平，其中箭头所指是M001-24转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组。图6是化学合成的siRNA转染细胞后实时定量PCR检测MITF基因的mRNA表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示MITF相对于GAPDH的mRNA表达水平，其中M001-24为M001-24转染组，“正常组”为正常培养细胞未转染组，“阴性对照组”为阴性对照siRNA转染组。图7是siRNA转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双链siRNA分子，其具有如下序列结构：正义链：5’?GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn?3’??????（SEQ?ID?NO:?3）反义链：5’?UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn?3’???????（SEQ?ID?NO:?4），其中，N为脱氧胸腺嘧啶核苷dT；n为0或2。
【技术特征摘要】
1.种双链SiRNA分子，其具有如下序列结构:正义链:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’(SEQ ID NO: 3)反义链:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱远源，李铁军，
申请(专利权)人：江苏吉康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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