靶向亲合体重组蛋白的构建及其表达和纯化方法，属于基因重组及生物分子材料制备技术领域。构建方法：在亲合体编码序列的基础上设计重组蛋白的核苷酸编码序列；对重组编码序列中的所有密码子按照表达宿主的密码子偏好性进行碱基优化；碱基优化后的重组基因片段由人工合成获得，再将重组片段双酶切，酶切产物纯化后连接到表达质粒上，构建重组表达质粒。表达和纯化方法：将已构建的重组质粒转化到密码子偏好对应的宿主中，加入诱导剂诱导重组亲合体的表达，验证重组蛋白是否表达；收集全部表达产物，经镍柱亲和层析初步纯化得到融合蛋白，用肠激酶酶切融合蛋白，再用凝胶柱层析进一步分离纯化，最后得到高纯度的重组亲合体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因重组及生物分子材料制备
，涉及。
技术介绍
亲合体是通过定向分子进化技术筛选获得的一类新型的独特的蛋白结合配体，其作用类似于抗体，但却拥有比抗体更加优越的性质:亲合体的结合位点与抗体相似且亲和力强；分子量小，不易在体内诱发免疫应答，组织穿透性好；性质十分稳定，可人工合成。亲合体的这些独特优势引起了科研工作者的关注，目前已发现的亲合体主要有Zhee2和Zkfk两类。研究人员利用Zhek2作为HER2高表达肿瘤疾病(宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等)的特定靶向配体，利用Z_亲和体作为EGFR高表达肿瘤疾病(皮肤癌等)的特定靶向配体，已展开了较多的研究，探索其各种潜在应用，包括肿瘤靶向成像和靶向治疗。有研究报道将ZHEK2:342亲合体与量子点或磁性氧化铁纳米颗粒连接，二者均在卵巢癌中实现了高的特定靶向能力。利用2_:19(17与64&1相偶联制成PET造影剂在人皮肤鳞状细胞癌A431细胞株中可实现很强的对比增强效果。以上研究结果表明这两种亲合体ZHEK2:342、Z_■可作为高亲和力的靶向分子与目标分子或探针连接，实现靶向功能化。随着现代纳米生物医学技术的发展，基于纳米技术的靶向性输送体系有望实现传统肿瘤诊断和治疗方法所无法企及的高效、低毒的效果，成为肿瘤诊断和治疗的有效手段之一。靶向分子是构建靶向性输送体系的重要因素，亲合体的独特优势决定了其可作为高亲和力祀向分子连接到纳米载体上，实现主动祀向。目前，将亲合体Z 臓:342、Zegfe:1907作为靶向分子进行靶向肿瘤能力的研究中，亲合体主要是通过化学合成获得的(1.0rlova A, et al.Synthetic affibodymolecules:A novel class of affinity ligands for molecular imaging ofHER2-expressing malignant tumors.Cancer Research.2007;67:2178-2186 ；2.GaoJHjet al.Affibody-based nanoprobes for HER2_expressing cell and tumorimaging.Biomaterials.2011;32:2141-2148 ；3.Tolmachev V，et al.Tumor TargetingUsing Affibody Molecules:1nterplay of Affinity, Target Expression Level,andBinding Site Composition.Journal of Nuclear Medicine.2012;53:953-960 ;4.Miao Z，et al.Smal 1-Animal PET Imaging of Human Epidermal GrowthFactor Receptor Positive Tumor with a64Cu Labeled Affibody Protein.Bioconjugate Chemistry.2010 ; 21: 947-954 ；5.Hoppmann S，et al.177Lu - D03A -HSA - Zegfe.1907 !characterization as a potential radiopharmaceutical forradionuclide therapy of EGFR-expressing head and neck carcinomas.Journal ofBiological Inorganic Chemistry.2012; 17: 709-718.)。但化学合成亲合体的方法成本较高，且杂质多，不易纯化。也有研究者通过构建表达载体在大肠杆菌中实现亲合体 Zhee2:342 矛口 ZEGFR:1907 的表达(6.0rlova A, et al.Tumor Imaging using a pi comolaraffinity HER2 binding affibody molecule.Cancer Research.2006;66:4339-4348 ;7.Gopal V，et al.Structure prediction and validation of an affibodyengineered for cell-specific nucleic acid targeting.Systems and syntheticbiology.2010;4:293-297 ；8.Govindarajan S，et al.Targeting human epidermalgrowth factor receptor 2 by a cell-penetrating peptide-affibody bioconjugate.Biomaterials.2012;33:2570-2582 ；9.Tolmachev V，et al.Affibody Molecules forEpidermal Growth Factor Receptor Targeting In Vivo:Aspects of Dimerization andLabeling Chemistry.Journal of Nuclear Medicine.2009; 50:274-283.)。但由于其中亲合体的编码序列未经优化，产物表达量较低，且产物与目标分子或探针的连接位点较少，不易实现祀向功能化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。用于表达和纯化重组靶向亲合体Cys-ZHEK2:342-6His的核苷酸序列为:GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.1)其中，中间下划线部分为亲合体ZHEK2:342的编码序列。用于表达和纯化重组靶向亲合体CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的核苷酸序列为: GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.2)其中，中间下划线部分为亲合体Ζ_.的编码序列。用于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的核苷酸序列顺序依次为=BamH I酶切位点、肠激酶酶切位点编码序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于表达和纯化重组靶向亲合体Cys?ZHER2:342?6His的核苷酸序列为：GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG记为SEQ:ID:NO.1；其中，中间下划线部分为亲合体ZHER2:342的编码序列。
【技术特征摘要】
1.关于表达和纯化重组靶向亲合体Cys-ZHEK2:342-6His的核苷酸序列为: GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG 记为 SEQ:1D: N0.1 ； 其中，中间下划线部分为亲合体ZHER2:342的编码序列。2.关于表达和纯化重组靶向亲合体CyS-ZE(；FK:19(l7-6HiS的核苷酸序列为: GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG 记为 SEQ:1D: N0 .2 ； 其中，中间下划线部分为亲合体ZEeFK:19(l7的编码序列。3.关于表达和纯化靶向亲合体重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：池小琴，王效民，尹震宇，高锦豪，朱祥龙，胡娟，
申请(专利权)人：厦门大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：
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