本发明专利技术涉及一种用于防控猪流行性腹泻病毒PEDV的特异性抗病毒肽核酸PNA，针对PEDV中N和S的基因保守部分设计高效特异性的反义核酸序列，并采用特定工艺人工合成肽核酸片段，该序列与上述保守性靶基因互补，根据碱基互补原理，反义核酸序列特异性地与PEDV中的N和S对应的靶基因相结合，诱导核酶对靶基因进行降解，从而阻断靶基因的转录与表达，抑制PEDV在机体内复制与装配，以达到防控猪流行性腹泻的目的。本发明专利技术还涉及含有该反义核酸序列的药物组合物，及其在动物药物上的用途。本发明专利技术无毒副作用，无耐药性，能特异性直接抑制PEDV复制，抗病毒效果好，无药残等食品安全问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，尤其是针对PEDV中N和S两种主要蛋白基因的保守区域涉及的病毒特异性的反义核酸序列以及由该核酸序列制备的肽核酸PNA。
技术介绍
猪流行性腹湾(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹湾病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的，以腹湾、呕吐、脱水为主要特征，是一种高度接触性肠道传染病。各种周龄、各个品种猪均可感染此病，其中对哺乳仔猪、架子猪及育肥猪影响最大，发病率高达100%，成年母猪发病率在15% 90%。PEDV发病特点为“日龄小，症状重，日龄大，症状轻”，发病急，流行快。I周龄哺乳仔猪通常会在腹泻3 4d后脱水死亡，病死率约50%。断奶猪、育肥猪症状较轻，腹泻可持续4 7d，成年猪仅发生呕吐和厌食。病猪是主要传染源，PEDV随粪便排出后，随PEDV污染的环境、饲料、饮水及用具等而感染，在发病规律上，其途径主要通过消化道。通常是大猪舍首发，发病后病猪水样腹泻，粪便呈草绿色，有恶臭，随后诱发全群腹泻，继而波及相邻猪舍并引起全场或某一地区相继感染发病。PED是世界范 围内发生的猪病之一，1971年英国首次被报道了 PED的发生，此后比利时、加拿大、德国、匈牙利、韩国及日本等多个国家相继报道了 PED的发生，PED每年均造成严重的经济损失。当前PED发生率居高不下，发病情况也越来越复杂，常出现与其它病毒混合感染的现象，因而倍受广大研究人员的重视。我国在1976年首次报道PED的发生，在20世纪80年代我国就不断的有PED的发生，发病区域遍及全国各省份，已报道该病在我国26个省市自治区均有发生。PED在国内常年发生，发病季节以秋、冬、春季多发。近年来，本病的流行区域有逐渐扩大的趋势。目前，PED已成为我国养猪业重要的腹泻病之一。随着集约化养殖规模的不断扩大，给该病的传播创造了有利条件。目前，主要采用疫苗接种来预防和控制该病。目前针对PED的疫苗主要有以下几种形式组织灭活苗、PED细胞灭活苗、PED弱毒苗、转基因植物疫苗、乳酸杆菌疫苗等。在欧洲和其他很多地区的血清学调查显示，PEDV毒株只有I种血清型，且尚无迹象表明存在不同的PED血清型。在长期流行的过程中，病毒为了更好地适应地区的环境差异，会随所处环境条件的改变而发生变异。因而要防控住该病毒的流行，需要开发特异性的药物。1991年国际病毒分类委员会(ICTV)第五次报告将PED列为冠状病毒属的可能成员，1995年第6次报告将其列为冠状病毒属的正式成员。PEDV属于套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae) α 冠状病毒属(A^pAacoronaVi^rus)的成员，具有囊膜的不分节段的单股正链RNA病毒。PEDV的基因结构及功能PEDV基因组是单股正链RNA，基因组核酸具有感染性，基因组结构与其他冠状病毒相似，5’端有一个帽子结构(cap)，3，端有一个Poly(A)尾，基因组全长为27000 33000nt (PEDV参考毒株CV777基因组大小为28 033 nt)。基因组5’端非翻译区(5’ UTR)位于复制酶多聚蛋白基因上游，大小为296 nt;5’UTR内含有长为65 98 nt的前导序列(L)和以AUG为起始密码子，同时拥有Kozak序列(GUUCaugC)和编码12个氨基酸的开放阅读框架(0RF)。迄今为止，除人冠状病毒HCV 229E外，已报道的其他冠状病毒成员都有Kozak序列,但序列有所差异。基因组3’端非翻译区(3’ UTR)长度为334 nt,末端连有Poly (A)序列，3’ UTR内含有由8个碱基(GGAAGAGC)组成的保守序列，起始于poly(A)上游的73 nt处，所有冠状病毒成员都包含这个序列，但在基因组中位置不同。PEDV基因组靠近3’端5kb区域内有5个主要的开放阅读框(0RF),编码4种结构蛋白:S蛋白(spike protein), sM蛋白(small membraneprotein),M 蛋白(membrane protein)和 N 蛋白(nucleoportein),位于 sM基因上游的 ORF,命名为0RF3，0RF3基因长675 nt，编码非结构蛋白，在每两个相邻基因之间有基因间隔序列(interval sequence, IS),它与基因组和亚基因组mRNA的L序列3’端有7 18 nt相同，在病毒基因组复制和翻译过程中发挥重要作用。复制酶多聚蛋白基因占全基因组2/3，长20 346 nt,包括ORFIa (12 354 nt)和ORFIb (8 037 nt) 2个开放阅读框架，二者之间有46 nt的重叠序列，重叠处有滑动序列(UUUAAAC)和假结节结构，它们能使核糖体进行移码阅读(frameshifting)从而保证基因I的正确翻译。PEDV基因组结构如附图说明图1所示。蛋白PEDV的N基因是已鉴定的ORF中最大的一个。N基因长达1700bp，编码一个441个氨基酸多肽。N基因处于PEDV基因组3’端，N基因的3’端和poly(A)尾之间有一个11个核苷酸的序列，这一序列在已测序的其它冠状病毒中都较保守。PEDV基因组的3’端这11个核苷酸的序列保守，为病毒复制过程中RNA负链合成的识别位点。N基因的5’端也存在一个类似于内部保守基因的7bp的序列。PEDV的N基因是最早被克隆的，所以对N基因的研究也较为详细。适应细胞生长的PEDV N基因含有三个内部开放阅读框(internal openreading frames, I 0RF)，分别被命名为1- 1( 113个密码子)，1- 2( 63个密码子)和1- 3( 72个密码子)，此三个I ORF均绝对保守。N蛋白为磷蛋白， 相对分子量为57kD。病毒感染细胞中N蛋白含量最为丰富。该蛋白等电点(Pl)高，缺少糖基化和RNA结合位点。此蛋白同其它冠状病毒MHV、IBV、HCV 0C43和 BCV 的一致性为 12% 19%,同 FIPV、CCV、PRCV、TGEV 和 HCV229E 的一致性为 32% 37%。PEDV与HCV229E的N蛋白最接近。N蛋白能与病毒多聚酶作用，或许还有可能同细胞因子作用，从而改变宿主细胞的转录。蛋白PEDV的S( spike)蛋白由S基因编码。该基因的启动密码子通常并不是用于启动蛋白质的合成，而是翻译分子量为151 kD的1383个Aa的多肽，此多肽含有29个潜在的糖基化位点，缺乏蛋白水解位点。生物信息学预测表明，PEDV S基因大多数糖基化位点都具有生物学意义。对S基因的序列保守性分析表明，PEDV S基因与HCV229E的序列分别有60.6% ( S2区)和37. 0% (SI)相同;%TGEV，FIPV和CCV相比，S序列则分别有59. 6% -60. 0% (SI)和 35. 5%- 35. 9% (S2 区)相同。PEDV 和 HCV229E 旁侧序列 KWPffffVWL 相同，该序列与KWPWYVWL相比仅有一个氨基酸不同，后者在迄今所测定的所有S蛋白基因中都显示了保守性。S蛋白在免疫介导中起着重要作用，S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，该反义核酸选自下列核酸序列中的一组或多组的组合：N?1:?5’?ttctaaggtacttgcaaataacg??3’；?N?2:?5’?ctcctacttcacgtgcaaattca??3’；?N?3:?5’?ctcttacgagattacatacaatt??3’；?S?1:?5’?gtgaaaaccagggtgtcaattca??3’；?S?2:?5’?tcgtaattgcctatttaacaaag??3’；S?3:?5’?ttcttaaagtggatacttacaac?3’。
【技术特征摘要】
1.一种抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，该反义核酸选自下列核酸序列中的一组或多组的组合N-1: 5，-ttctaaggtacttgcaaataacg _3，；N-2: 5’ -ctcctacttcacgtgcaaattca _3’ ；N-3: 5’ -ctcttacgagattacatacaatt -3’ ；S-1: 5，-gtgaaaaccagggtgtcaattca _3，；S-2: 5’ -tcgtaattgcctatttaacaaag _3’ ；S-3: 5’ -ttcttaaagtggatacttacaad’。2.如权利要求1所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，所述反义核酸制备成肽核酸PM。3.如权利要求2所述的抗猪流行性腹泻病毒PEDV的反义核酸，其特征在于，所述肽核酸PNA与咪唑丙烯酸壳聚糖UA...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩健宝，曲向阳，顾宏伟，王远孝，马国辅，
申请(专利权)人：韩健宝，
类型：发明
国别省市：
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