本发明专利技术提供一种抑制人hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸药物，是采用合成的方式形成5’端aaga和3’端的tttcc硫代修饰，是针对hPEBP4基因mRNA393-411位的21个碱基，称为OND-hPEBP4，可在制备抗乳腺癌药物中的应用。本发明专利技术在基因水平针对hPEBP4基因的反义寡核苷酸能提高肿瘤药化疗药物的敏感性，达到治疗肿瘤的目的。本发明专利技术研制的反义寡核苷酸能有效抑制hPEBP4的表达，为反义寡核苷酸技术应用于肿瘤的治疗提供了实验证据和有效新药。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物制药，涉及一种反义寡核苷酸，特别是涉及一种抑制人hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸及其在制备肿瘤治疗药物中的应用。
技术介绍
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡现象，在肿瘤发生、发展、肿瘤治疗、胚胎发育、免疫反应、神经系统发育、组织细胞代谢等过程中起重要作用。肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，主要是由于细胞内癌基因、抑癌基因及其他相关调节基因突变，从而使细胞基因组失去稳定性，最终导致肿瘤的发生。细胞凋亡是细胞监测系统重要的组成部分，如果其出现异常，会导致本应凋亡的细胞“非法”存活，造成细胞的失控性增殖，产生高度恶化状态的肿瘤细胞。在细胞癌变过程中，许多凋亡活化基因功能受阻，而凋亡抑制基因的功能得到增强。已经发现，不少肿瘤的发生机制就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、慢性白血病等。由于细胞凋亡异常在许多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。目前临床上采用的放射治疗，大多数化疗药物和生物治疗剂主要都是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。科学家们对未来肿瘤治疗的展望是通过凋亡疗法来增加杀死肿瘤的敏感性和特异性。即以诱导细胞凋亡为目标的基因治疗，通过分子生物学的途径在肿瘤细胞内导入诱导凋亡的活化基因或灭活凋亡的抑制基因，特异性的恢复并增强肿瘤细胞内的凋亡功能，提高肿瘤对放疗和化疗药物的特异性和敏感性，达到有效治疗肿瘤的目的。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ONDs)的概念最早提出于1967年，经过30多年的研究,人们已意识到在各种反义寡核苷酸的领域里，有可能寻找到更有效的抗病毒和抗肿瘤新药。其主要是根据碱基互补配时原则和核酸杂交原理，利用人工合成、天然存在的互补寡核苷酸片段，以反向互补方式特异性地与目的基因(单链、双链)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相结合，从基因复制、特录、剪接、转运翻译等水平上调节靶基因的表达，干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传 递，从而达到抑制、封闭或破坏靶基因表达，达到治疗疾病的目的。磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)蛋白是一类能与磷脂酰乙醇胺(PE)结合的蛋白。该家族的所有成员都含有与PE结合的保守区域，PEBP家族来源广泛，包括果蝇触觉的气味结合蛋白(0ΒΡ)、盘尾丝吸虫感染后的免疫血清识别的抗原Agl6，酵母中抑制CDC25突变的TFSl因子，哺乳动物的Raf-kinase inhibitor, RKIP等等。PEBP存在于组织细胞液，不存在于血清，淋巴液和乳液。在大脑特别是少突状足细胞和男性生殖器官高表达，在膜的生物合成和维持膜隔离抗原中扮演着重要的角色。人和小鼠大脑中PEBP为十一氨基酸多肽海马趾类胆碱神经刺激肽(HCNP)前体蛋白，而HCNP促进乙酰胆碱的合成。PEBP家族成员功能广泛，涉及到抵抗凋亡，膜形成，精子的成熟等各方面的生理功能，并与肿瘤的发生、发展、转移具有一定的相关性。hPEBP4从正常人骨髓基质细胞中分离到一种新型PEBP，属于PEBP第四类亚家族，与PEBP家族蛋白具有高度同源性，在75位到195位为磷脂酰乙醇胺结合保守区域(PBP)其序列已在GenBank登录(GenBank登录号AY037148)。hPEBP4高表达于乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌LINCaP细胞、卵巢癌CaoV_3细胞等多种培养细胞系，通过相关试验我们证明了 hPEBP4在L929细胞中的过表达能抑制TNF α诱导的凋亡，而hPEBP4在上述肿瘤细胞中的表达沉默能促进TNF α诱导凋亡。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抑制人hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为5 AAGGAGAGAGATGACTTTTCC 3，(SEQ ID Nol)，是采用合成的方式形成 5’ 端 aaga和3’端的tttcc硫代修饰，是针对hPEBP4基因mRNA 393-411位的21个碱基，称之为0ND-hPEBP4o本专利技术的另一个目的是提供一种抑制hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸在制备抗乳腺癌药物中的应用，是特异性的靶向性针对抗凋亡基因hPEBP4及其表达蛋白，作用的靶位点 5’GGAAAAGTCATCTCTCTCCTT3’ (393-411)位。反义寡核苷酸序列 SEQ ID Nol 为 5，AAGGAGAGAGATGACTTTTCC 3’ 。所述给药途径可采用直接裸核酸注射法、脂质体包裹核酸直接注射法、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、重组复制缺陷型病毒携带核酸感染细胞法等其中的一种。利用化疗药物诱导肿瘤发生凋亡是国内外抗肿瘤研究的热点，但是某些类型的肿瘤如乳腺癌、前列腺癌等可能对化疗药物不敏感，从而限制了化疗药物的临床应用。本专利技术采用反义寡核苷酸技术，使本来乳腺癌MCF-7细胞中的hPEBP4表达沉默，可增强MCF-7乳腺癌细胞对化疗药物如TNF-a的敏感性，因此具有广阔的应用前景。本专利技术的反义寡核苷酸可以单独使用，或者与其 他化疗药物增敏剂如反义核酸制成药物组合，用于hPEBP4高表达肿瘤的治疗。本专利技术提供的一种肿瘤治疗的hPEBP4反义寡核苷酸药物，在基因水平针对hPEBP4基因的反义寡核苷酸能提高肿瘤药化疗药物的敏感性，达到治疗肿瘤的目的。本专利技术研制的反义寡核苷酸能有效抑制hPEBP4的表达，为反义寡核苷酸技术应用于肿瘤的治疗提供了实验证据和有效新药。附图说明图1是本专利技术反义寡核苷酸处理36h后乳腺癌MCF-7细胞hPEBP4的PCR扩增产物电泳图和蛋白表达的western印迹图。图2是本专利技术反义寡核苷酸处理对TNFa诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的影响的结果O具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术的抗肿瘤特异性抑制hPEBP4基因表达的hPEBP4反义寡核苷酸药物作进一步的详细说明。实施例1 :0ND-hPEBP4转染对hPEBP4的mRNA和蛋白表达影响的检测所设计的OND序列是针对hPEBP4 mRNA 393-411位点选取的I段21个碱基的DNA序列，其特征是采用合成的方式并形成5’端aaga和3’端的tttcc硫代修饰称之为0ND-hPEBP4。另设阴性对照OND寡核苷酸(0ND_neg)，为与人、大鼠小鼠基因均无任何同源性的杂乱序列。OND序列如下 0ND-hPEBP4 5 AAGGAGAGAGATGACTTTTCC 3’ (393-411) OND-neg5’ - UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3’ 反义寡核苷酸的体外化学合成由上海吉凯公司完成。本专利技术所用的MCF-7 (ATCC:HTB-22)细胞系是阳性表达hPEBP4的肿瘤细胞系。细胞接种于含10%的小牛血清的RPMI1640 (Invitrogen公司)培养液，置于37摄氏度、体积分数为5%的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。OND转染主要步骤为待转染的OND用无血清的Opt1-MEM (Invitrogen)稀释,与Oligofectamine按一定比例混合，室温作用20分钟；生长于6孔细胞培养板或IOmm培养皿的待转染细胞培养至6本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为：5?AAGGAGAGAGATGACTTTTCC?3’，是针对hPEBP4基因mRNA?393?411位的21个碱基，采用合成的方式形成5’端aaga?和3’端的tttcc硫代修饰，称之为OND?hPEBP4。
【技术特征摘要】
1.一种抑制hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸，其核苷酸序列为5AAGGAGAGAGATGACTTTTCC 3’，是针对 hPEBP4 基因 mRNA 393-411 位的 21 个碱基，采用合成的方式形成5’端aaga和3’端的tttcc硫代修饰,称之为0ND_hPEBP4。2.根据权利要求1所述的一种抑制hPEBP4基因表达的反义寡核苷酸在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，是靶向性...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓健，李晖，蒋瑜，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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