嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂制造技术

公开了可用于借助于反义效应改变靶基因的表达的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂。嵌合单链反义多核苷酸和双链反义试剂包括中心核苷酸区域，所述中心核苷酸区域的侧翼为第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域的修饰的核苷酸，第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域它们自身的侧翼为第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸，所述第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸对蛋白质具有低亲和力和/或比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消失。双链反义试剂还包括退火至反义链的互补链。多核苷酸可用于修饰细胞内的RNA转录水平、miRNA活性或蛋白质水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及可用于借助于反义效应修饰靶基因的表达的嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂。嵌合单链反义多核苷酸包括中心核苷酸区域，所述中心核苷酸区域的侧翼为第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域的修饰的核苷酸，第一5’-侧翼区域和第一3’-侧翼区域它们自身的侧翼为第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸，所述第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域的核苷酸对蛋白质具有低亲和力和/或比天然的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送嵌合多核苷酸时，在细胞内消失。双链反义试剂包括嵌合单链多核苷酸。双链反义试剂还包括互补链。嵌合单链多核苷酸和双链反义试剂可用于修饰细胞内的RNA转录水平或蛋白质水平。
技术介绍
近年来，寡核苷酸已经成为称为核酸药物的药物产品的持续研发中感兴趣的对象，且具体地，从靶基因的高选择性和低毒性的观点来看，利用反义方法的核酸药物的研发正在积极地进行中。反义方法包括通过向细胞内引入与靶基因的mRNA(有义链)的部分序列互补的寡核苷酸(反义寡核苷酸(ASO))，选择性地修饰或抑制由靶基因编码的蛋白质的表达的方法。类似地，反义方法还靶向miRNA并起作用以修饰这样的miRNA的活性。如图1所示(上部)，当将包括RNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，ASO结合到靶基因的转录产物(mRNA)，且形成部分双链。众所周知，这种双链起遮蔽物的作用，以预防被核糖体翻译，并因此抑制由靶基因编码的蛋白质的表达。另一方面，当将包括DNA的寡核苷酸作为ASO引入细胞时，形成部分DNA-RNA异源双链体。因为RNA酶H识别这种结构，且从而分解靶基因的mRNA，抑制由靶基因编码的蛋白质的表达(图1，下部)。在很多情况下，与利用RNA ASO的情况相比，当DNA被用作ASO时(RNA酶H-依赖的途径)时，基因表达抑制效应更高。当利用寡核苷酸作为核酸药物时，研发出了多种核酸类似物诸如锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)(注册商标)、其他桥接的核酸(BNA)等等，以增强对靶RNA的结合亲和力和体内稳定性。如图2所示，由于天然核酸(RNA或DNA)的糖部分具有四个碳原子和一个氧原子的五元环，糖部分具有两种构象，N-型和S-型。众所周知，这些构象从一个构象转向另一个构象，并且从而，核酸的螺旋结构也采取不同的形式，A-型和B-型。由于充当前述ASO的靶的mRNA采取A-型的螺旋结构，糖部分主要地为N-型，因此从增加对RNA的亲和力的观点来看，ASO的糖部分采取N-型是非常重要的。在这种理念下研发的产品为修饰的核酸诸如LNA(2’-O,4’-C亚甲基-桥接的核酸(2’,4’-BNA))。例如，在LNA中，由于通过亚甲基基团桥接2’-位置的氧和4’-位置的碳，构象被固定为N-型，且在构象之间不再存在波动。因此，与利用传统的天然核酸合成的寡核苷酸相比，通过并入若干单元的LNA合成的寡核苷酸具有非常高的对RNA的亲和力和非常高的序列特异性，并且还表现出极好的耐热性和核酸酶耐受性(参见专利文献1)。由于其他人工核酸也具有这样的特性，已经将很多注意力放在了与反义方法的利用等等相关的人工核酸上(参见专利文献1至9)。尽管如此，即使利用这些高性能修饰的核酸的反义寡核苷酸的设计物，仍然缺少用作治疗剂的合适的效率、效力和/或安全性。众所周知，ASO的长度显著地影响ASO的性能，但是具有两种形成鲜明对比的结果(非专利文献5-7)。更长的探针长度(例如，16-22个核苷酸)提供了对靶向的RNA序列的更高的结合强度(更高的Tm)和更大的特异性。更大的序列特异性通常导致较少的副作用且很少或没有毒性。然而，更长的探针的效力低。为了补偿这样低的活性，需要大的剂量。相反，较短的探针长度(例如，12-15个核苷酸)最有效-这个长度范围通常提供了基因表达水平的最高的阻抑或抑制程度。然而，较短的探针具有较低的序列特异性并因此通常引起毒性副作用。因此，对提供较短的ASO的效率和效力但是同时具有较长的ASO的安全性的多核苷酸存在需求。此外，当将反义寡核苷酸用作药物时，可以以高特异性和高效率将相关的寡核苷酸递送至靶位点是重要的。用于递送寡核苷酸的方法包括利用脂质诸如胆固醇和维生素E(非-专利文献1和2)、利用受体-特异性的肽诸如RVG-9R(非专利文献3)、或利用靶位点特异性的抗体(非专利文献4)。引用列表专利文献{PTL 1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’‑侧翼区域，所述第一5’‑侧翼区域包括1‑10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’‑侧翼区域，所述第一3’‑侧翼区域包括1‑10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和第二5’‑侧翼区域和/或第二3’‑侧翼区域，其中：所述第二5’‑侧翼区域连接到所述第一5’‑侧翼区域的5’末端且包括至少1个低蛋白质‑亲和力核苷酸；且所述第二3’‑侧翼区域连接到所述第一3’‑侧翼区域的3’末端且包括至少1个低蛋白质‑亲和力核苷酸；其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质‑亲和力核苷酸的总数不超过100个核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.01 US 61/771,115;2013.03.31 US 61/806,887;1.一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一
5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一
3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
所述第二5’-侧翼区域连接到所述第一5’-侧翼区域的5’末端且包括至
少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；且
所述第二3’-侧翼区域连接到所述第一3’-侧翼区域的3’末端且包括至
少1个低蛋白质-亲和力核苷酸；
其中核苷酸、核苷酸类似物和低蛋白质-亲和力核苷酸的总数不超过
100个核苷酸。
2.一种嵌合反义多核苷酸，所述嵌合反义多核苷酸包括：
包括至少5个核苷酸的中心核苷酸区域；
连接到所述中心核苷酸区域的5’末端的第一5’-侧翼区域，所述第一
5’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；
连接到所述中心核苷酸区域的3’末端的第一3’-侧翼区域，所述第一
3’-侧翼区域包括1-10个核苷酸，其中至少1个是核苷酸类似物；和
第二5’-侧翼区域和/或第二3’-侧翼区域，其中：
所述第二5’-侧翼区域连接到所述第一5’-侧翼区域的5’末端，比天然
的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所
述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；且
所述第二3’-侧翼区域连接到所述第一3’-侧翼区域的3’末端，比天然

\t的DNA或RNA具有更高的对DNA酶或RNA酶的耐受性，且当递送所
述嵌合多核苷酸时，在细胞内消失；
其中核苷酸和核苷酸类似物的总数不超过100个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核
苷酸区域包括这样的核苷酸：当与RNA多核苷酸杂交时，所述中心核苷
酸区域/RNA多核苷酸双链体被RNA酶H识别。
4.根据权利要求3所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸
区域的核苷酸独立地选自DNA和硫代磷酸酯DNA核苷酸。
5.根据权利要求4所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸
区域包括5-20个DNA核苷酸。
6.根据权利要求4所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸
区域包括5-12个DNA核苷酸。
7.根据权利要求1或2所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核
苷酸区域包括独立地选自RNA核苷酸和核苷酸类似物的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述核苷酸类似
物独立地选自LNA核苷酸、BNA核苷酸、2’-O-Me RNA核苷酸、2’-O-
甲氧乙基RNA核苷酸。
9.根据权利要求8所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸
区域包括独立地选自2’-O-Me RNA核苷酸和2’-O-甲氧乙基RNA核苷酸
的核苷酸。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
中心核苷酸区域中的核苷酸中的至少一个被硫代磷酸酯化。
11.根据权利要求10所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述中心核苷酸
区域中的所有核苷酸都被硫代磷酸酯化。
12.根据权利要求1-11的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
第一侧翼区域中的核苷酸是桥接的核苷酸。
13.根据权利要求1-12的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述

\t桥接的核苷酸独立地选自LNA、cEt BNA、酰胺BNA和cMOE BNA。
14.根据权利要求1-13的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
中心核苷酸区域和所述第一侧翼区域中的核苷酸类似物中的至少一个被
硫代磷酸酯化。
15.根据权利要求1-14的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
低蛋白质-亲和力核苷酸独立地选自2’-O-甲基RNA核苷酸、2’-O-甲氧乙
基RNA核苷酸、LNA、cMOE BNA、2-氟RNA核苷酸、硼烷磷酸酯核苷
酸、甲基磷酸酯核苷酸、亚磷酰胺核苷酸、5-甲基胞嘧啶、UNA和5-丙炔
基尿嘧啶。
16.根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
嵌合反义多核苷酸包括第二5’-侧翼区域。
17.根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
嵌合反义多核苷酸包括第二3’-侧翼区域。
18.根据权利要求1-15的任一项所述的嵌合反义多核苷酸，其中所述
嵌合反义多核苷酸包括第二5’-侧翼区域和第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：横田隆德，仁科一隆，水泽英泽，和田健，
申请(专利权)人：国立大学法人东京医科齿科大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP