表达盒制造技术

本发明专利技术涉及：(1)具有对应于转录激活因子结合域的序列的表达控制区；和(2)编码能够结合至所述表达控制区的转录激活因子的核酸。本发明专利技术提供了包括以能够发挥功能的方式连接至所述表达控制区的核酸的表达盒；用于在哺乳动物细胞中表达目的产物的方法，所述方法使用了所述表达盒；用于生产表达目的产物的细胞的方法；用于在哺乳动物细胞中生产目的产物的方法；和包括所述表达盒的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及可用于生产基因工程化的产物的表达盒，和所述表达盒的用途。
技术介绍
为了生产多肤，诸如重组蛋白，使用了通过使用质粒载体或病毒载体将编码多肤 的核酸引入原核生物、酵母、昆虫细胞、原生动物、哺乳动物细胞等，并且通过使用宿主细胞 中的蛋白质生产系统转录和翻译所述核酸的方法。特别地，使用哺乳动物细胞的方法不但 适合于在蛋白质工程和分子遗传学，还适合于在免疫工程、基因治疗和药物产品生产的领 域中的研究或临床应用，因为翻译后修饰与人的相同，和来源于哺乳动物的蛋白质可W被 正确地折畳等。 然而，相比于使用原核生物或酵母的方法，在使用哺乳动物细胞生产重组蛋白的 方法中，获得的产物通常不足。作为解决该问题的技术，例如，已知在使用人细胞的重组蛋 白质表达系统中，将附加型维持系统（episomalmaintenancesystem)和强力的启动子/ 增强子添加至具有反式激活系统的蛋白质表达系统的技术（专利文献1)，和通过人TRBP (其是1型人免疫缺陷病毒（在下文中，称为HIV-1)TAR的结合因子）至TAR的结合作用， 在具有CMV启动子和反式激活应答区（在下文中，称为TAR)的表达调节区的控制下，改善 蛋白质表达的技术（非专利文献1)。 引用列表 专利文献 专利文献 1 ;W02002/027005 非专利文献 非专利文献 1;TheJournalofBiologicalQiemistry,Vol. 278,PP. 4440-4448 (2003)〇[000引专利技术概述 本专利技术解决的问题 本专利技术的目标是提供用于高表达目标产物等而没有复杂操作的方法。 问题的解决方案 本专利技术人深入研究了用于改善目标产物表达量的方法。结果，本专利技术人构建了表达盒， 其中编码结合于转录激活因子结合区的转录激活因子的核酸可操作地连接至具有对应于 转录激活因子结合区的序列的表达调节区。随后，本专利技术人发现通过下述的组合改善了目 标产物的表达量；将所述盒作为第一表达盒（在下文中，也称为"转录激活因子表达盒"）引 入至哺乳动物细胞和将其中用于表达目标产物的核酸可操作地连接至具有对应于与转录 激活因子表达盒的相同的转录激活因子结合区的序列的表达调节区的第二表达盒（在下 文中，也称为"目标产物表达盒"）引入至哺乳动物细胞，并且因此完成本专利技术（图1)。根 据本专利技术，不但多肤的生产，而且RNA或病毒载体的生产也W高效率实现。 本专利技术概述如下。本专利技术设及： 山表达盒，其包含W下（1)和（2); (1) 具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；和 (2) 编码能够结合至所述表达调节区的转录激活因子的核酸，其中所述核酸可操作地 连接至表达调节区； 的表达盒，其中用于表达目标产物的核酸进一步可操作地连接至所述具有对 应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区； 或的表达盒，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源 变体； -中任一项的表达盒，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反 式激活应答区或其功能同源序列；[引在哺乳动物细胞中表达目标产物的方法，其包括W下步骤（a)和化）： (а) 将第一表达盒和第二表达盒引入细胞，所述第一表达盒包含第一表达调节区和可 操作地连接至所述第一表达调节区的编码转录激活因子的核酸，所述第二表达盒包含第二 表达调节区和可操作地连接至所述第二表达调节区的用于表达目标产物的核酸；和 化）培养在步骤（a)中获得的细胞， 其中所述第一表达调节区和所述第二表达调节区具有对应于在第一表达盒中编码的 转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列； 在哺乳动物细胞中表达目标产物的方法，其包括W下步骤（a)和化）： (a)将的表达盒引入细胞，其中用于表达目标产物的核酸进一步可操作地连接至 具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；和 化）培养步骤（a)中获得的细胞；的方法，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源变 体；中任一项的方法，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反式 激活应答区或其功能同源序列； 生产表达目标产物的细胞的方法，其包括： 将包含第一表达调节区和编码可操作地连接至所述第一表达调节区的转录激活因子 的核酸的第一表达盒，和包含第二表达调节区和可操作地连接至所述第二表达调节区的用 于表达目标产物的核酸的第二表达盒引入至哺乳动物细胞中的步骤， 其中所述第一表达调节区和所述第二表达调节区具有对应于在第一表达盒中编码的 转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列； 生产表达目标产物的细胞的方法，其包括： 将的表达盒引入至哺乳动物细胞中的步骤，其中用于表达目标产物的核酸进一步 可操作地连接至具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区； 或的方法，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或其功能同源 变体； 巧]-中任一项的方法，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的反 式激活应答区或其功能同源序列； 在哺乳动物细胞中生产目标产物的方法，其包括W下步骤（a)和化）： (a)通过-巧]中任一项的方法表达目标产物；和 化）获得表达的目标产物；包括W下（1)和似的试剂盒： (1) 第一表达盒，其包含第一表达调节区和可操作地连接至所述第一表达调节区的编 码转录激活因子的核酸；和 (2) 第二表达盒，其包含第二表达调节区和可插入用于表达目标产物的核酸，从而使 所述核酸可操作地连接至所述第二表达调节区的位点， 其中所述第一表达调节区和所述第二表达调节区具有对应于在第一表达盒中编码的 转录激活因子所结合的转录激活因子结合区的序列；的试剂盒，其中所述第一表达盒和第二表达盒分别包含在不同的核酸构建 体中； 的试剂盒，其中所述第一表达盒和第二表达盒包含相同的核酸构建体中； 包括的表达盒的试剂盒，其中所述第一表达盒进一步包含可插入用于表达 目标产物的核酸，从而使所述核酸可操作地连接至第一表达调节区的位点；-中任一项的试剂盒，其中所述转录激活因子是免疫缺陷病毒的Tat或 其功能同源变体；和 -[1引中任一项的试剂盒，其中所述转录激活因子结合区是免疫缺陷病毒的 反式激活应答区或其功能同源序列。[000引本专利技术的效果 根据本专利技术，提供了可用于在细胞中供应转录激活因子的转录激活因子表达盒。此外， 提供了用于表达目标产物的方法和用于生产目标产物的方法W及用于生产表达目标产物 的细胞的方法，其使用该转录激活因子表达盒和在表达调节区中具有对应于所述转录激活 因子所结合的转录激活因子结合区的序列的目标产物表达盒。此外，还提供了在所述方法 中使用的试剂盒。本专利技术不但对蛋白质工程和分子遗传学，还对免疫工程、基因治疗和药物 生产领域的基础研究或临床应用非常适用。 附图简述图1显示了本专利技术的构思。图A是一般目标产物表达盒的示意图。图B是使 用表达Tat的转录激活因子表达盒和包含具有对应于TAR的序列的表达调节区的目标产物 表达盒的根据本专利技术的表达方法的示意图。 [图引图2显示了在实施例2-(1)中制备的细胞裂解物的SDS-聚丙締酷胺凝胶 电泳的结果。 图3显示了在每个测试条件下的Tat信号强度。 本专利技术的实施方式 如在本文中使用的，表达盒是指包含表达目标产物所需元件的核酸构建体。具体地，该 是指本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达盒，其包含以下(1)和(2)：(1) 具有对应于转录激活因子结合区的序列的表达调节区；和(2) 编码能够结合至所述表达调节区的转录激活因子的核酸，其中所述核酸可操作地连接至所述表达调节区。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：百百克行，月原多佳久，霜村真弓，井上晃一，蝶野英人，峰野纯一，北川正成，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP