块根特异启动子SpoA-p制造技术

本发明专利技术公开了一个块根特异启动子SpoA-p，其具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。此启动子克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性持续、高效表达所造成浪费的特点,从而避免了在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。红薯是属于块根作物，此特异启动子能使根部外源基因得到表达，用于红薯高淀粉等性状的定向育种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术，尤其涉及的是一个块根特异启动子SpoA-p，此类启动子克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性持续、高效表达所造成浪费的特点，从而避免了在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。红薯是属于块根作物，此特异启动子能使根部外源基因得到表达，用于红薯高淀粉等性状的定向育种。
技术介绍
启动子是指RNA聚合酶及一些反式作用因子识别并与之结合从而正确有效地起始转录的一段特异性的DNA序列。不同的启动子使基因具有不同的表达特性。能够使基因在大多数的细胞类型中表达的启动子称为组成型启动子，使基因表达能够对特异条件产生响应的启动子为特异性启动子。植物基因工程技术在解决人类所面临的粮食、能源和环境危机等方面发挥了很大的作用并显示了良好的前景，在植物育种上，他能导入新的基因引入新的性状，弥补传统育种的缺陷。转基因植物中使用较多的是组成型表达启动子，它们是植物基因工程中应用最早、最广泛的一类启动子。具有持续性，表达量基本恒定。然而，在其发展过程中也不可避免地遇到一些问题，例如外源基因在受体植物内往往会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等现象，导致转基因植物无法投入投入实际应用。也正由于这种特点使得外源基因产物可能对植物的生长发育产生不利影响，甚至导致死亡。此外，重复使用同一种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起基因沉默或共抑制现象。而使用组织特异启动子可以解决这些缺点。甘薯储藏蛋白(Sporamin)是一类块根特殊蛋白质，于1985年由Maeshima发现，存在于甘薯块根中而其他器官中则无(Maeshima et al.，1985),占块根可溶性蛋白的60%-80%，在植物块根中以单体的形式出现，与马铃薯中的Patatin蛋白以及薯蓣中的Discorin蛋白同属变态根莖器官中的特异忙藏蛋白。储藏蛋白分为A、B两个亚族Sporamin A和 Sporamin B (Hattori et al. , 1989; Murakami et al.，1986),每个亚基因家族都包含6个以上的成员(ffettstein and Chua, 1987)。Sporamin的表达具有块根特异性，与块根形态器官的发生有着密切的关系(Hattori and Nakamura, 1988;Hattori et al. , 1991;Ohto et al. , 1992;Takeda etal.，1995)，同时受到植株发育阶段和光合产物的调控。Sporamin是甘薯块根特异贮藏蛋白，其启动子也应具有块根特异性，克隆到该启动子，就可以构建外源基因在甘薯块根中表达的载体，从而实现甘薯块根特异表达 外源基因的目的。为此，本研究根据已知Sporamin A基因序列设计引物，通过PCR扩增获得了启动子片段，用克隆的启动子表达GUS基因并分析了该启动子在烟草和甘薯植株的表达特异性。Sporamin的表达具有块根特异性，与块根形态器官的发生有着密切的关系(Hattori and Nakamura, 1988;Hattori et al. ,1991;Ohto et al. , 1992;Takeda etal.，1995)，同时受到植株发育阶段和光合产物的调控。Sporamin是甘薯块根特异贮藏蛋白，其启动子也应具有块根特异性，克隆到该启动子，就可以构建外源基因在甘薯块根中表达的载体，从而实现甘薯块根特异表达外源基因的目的。
技术实现思路
本专利技术提供了一个块根特异启动子SpoA-p，此启动子克服了组成型启动子启动外源基因在受体植物中非特异性持续、高效表达所造成浪费的特点，从而避免了在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效果。红薯是属于块根作物，此特异启动子能使根部外源基因得到表达，用于红薯高淀粉等性状的定向育种。。本专利技术的技术方案如下块根特异启动子SpoA-p，其具有SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列。组织特异启动子能使基因定时定位的表达，减少过量表达产物的堆积，SpoAp是一个可诱导性的块根特异启动子，该启动子可以为植物块根特异表达系统研究提供帮助。有研究表明sporamin含量与甘薯块根中淀粉含量呈正相关，通过此启动子的研究能使淀粉合成相关基因在块根中得到特异表达，提高淀粉含量，探索块根淀粉、储藏蛋白的合成机理中的相互关系，为选育获得闻淀粉新品种奠定基础。附图说明图1 为 SpoA-p 的克隆；M:marker V ; 1-4 IIOObp 的 SpoA-p ；图2 为双酶切鉴定 pBI121-SpoA-p:gus ；图3为转基因烟草的获得；其中左图为叶片侵染后共培养；中间图为筛选培养上生成愈伤后出苗；右图为完整烟草再生植株；图4为转基因甘薯的阳性植株，其中左图为茎段在筛选培养基上长成愈伤；中间图为叶片在筛选培养上生成愈伤；右图为甘薯完整再生植株；图5为再生植株PCR鉴定；左图烟草；M:500bp marker ； 1-7, 8-10:阳性植株；7、11 :阴性植株；12 :阴性对照；13:阳性对照；右图甘薯;M:marker V ；1 :阴性对照；2 :阳性对照；3_10 :阳性植株；11 :阴性植株；图6为烟草转基因植株的⑶S染色；烟草根部⑶S染色成蓝色；图7为烟草对照与转基因植株蔗糖诱导前后GUS染色情况；A:烟草对照(左)；阳性再生植株(中)；5%蔗糖诱导抗性再生植株(右)；B:b脱去背景色；C:c脱去背景色；D、E、F:分别为C图中的染色根、叶、茎；G、H:显微镜下观察抗性再生植株根染色；图8为甘薯转基因诱导前后⑶S染色，A :转基因植株⑶S染色；B，C:5%蔗糖诱导后GUS染色；具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。实施例1、启动子克隆与 分析川薯34为实验材料提取总DNA，经电泳检测及紫外分光光度计分析。设计引物SpoA-p FAAGCTTTGCCAAACAGAGCCTAAATCCATC,SpoA-p R GGATCCTCATGGTGG CAGATGAGATGACAA,下划线的序列分别为引入的限制性内切酶Hind II1、BamH I的识别位点。PCR扩增片段，扩增条件为94°C 5min，94°C lmin, 56°C lmin20s,72°C lmin，30 个循环。电泳检测PCR产物，回收片段与克隆载体PMD19-T连接，亚克隆测序，得到了 1144bp的SpoA-p片段(如图1)。PLACE数据库(A database of plant cis-acting regulatory DNA elements)在线分析表明此启动子具有核心启动子元件CAATB0X1，豌豆豆球蛋白基因中此共有序列能控制组织特异性启动子的活性；元件SREATMSD跟蔗糖表达相关；959 (-) CANBNNAPA含序列CNAACAC，是油菜储藏蛋白启动子核心组件，胚及胚乳中napin蛋白转录必须的调控因子，具有特异性；300(_)ELEMENT在大麦醇溶蛋白及小麦麦谷蛋白基因启动子的上游元件中也存在；959(-)2SSEEDPR 0TBANAPA在很多储藏蛋白启动子中存在，与储藏蛋白基因Nap4启动子的高活性有重要的关联；AC本文档来自技高网...

【技术保护点】
块根特异启动子SpoA?p，其具有SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.块根特异启动子Sp0A-p，其具有S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张聪，郑雪莲，蒲志刚，张婷，屈会娟，李明，吴洁，谭文芳，杨松涛，王大一，阎文昭，
申请(专利权)人：四川省农业科学院生物技术核技术研究所，
类型：发明
国别省市：