检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法技术

本发明专利技术提供了一种检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法，通过将探针药物、测试药物与含有所述细胞色素P450的人肝微粒体共同孵育后，检测探针药物的代谢产物，可有效地检测测试药物对细胞色素P450的抑制作用，为工业上药物的研发、筛选、和临床上用药指导提供一种便利的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种医药检测技术，尤其涉及一种检测药物对人细胞色素P450 (或其亚型)抑制作用的方法。
技术介绍
药物相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用。药动学相互作用可发生在吸收、分布、代谢、排泄4个阶段，其中代谢性相互作用发生率最高，约占药动学相互作用的40%，具有非常重要的临床意义。药物代谢的主要场所是肝脏，肝脏进行生物转化则依赖于微粒体中的多种酶系，其中最重要的是细胞色素P450混合功能氧化酶(简称CYP450)。细胞色素P450是人体最重要的药物代谢酶，主要分布于肝脏，参与内源性物质 (如类固醇激素、花生四烯酸等)和外源性物质(如药物、环境致癌物等)的生物转化，药物在人体内的许多代谢动力学特征，如药物半衰期、肝脏首过效应、药物相互作用、清除率和生物利用度等均和参与其代谢的细胞色素P450有关。细胞色素P450又被称为肝微粒体酶，其包括多种亚型，其中参与药物代谢的亚型主要有CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4 等。CYP450可受遗传、年龄、机体状态、营养、疾病、吸烟、饮酒等各种因素的影响，尤其药物能够明显影响药酶的活性。代谢性药物相互作用在药品不良反应中占有很大比例，但是，目前由于对用药者还不能普遍地开展相关基因遗传多态性检测，用基因芯片检定整个人类基因寻找药效相关的多态性点位的做法也不切实际，为减轻或避免代谢性药物相互作用的发生，最简便易行的方法是合理选用药物，目前，代谢性药物相互作用已成为申报新药的必备项目，因此，考察药物对人细胞色素P450的抑制作用，进行前瞻性的早期预防，可避免药物相互作用引起的毒副作用或疗效降低，对于药物筛选、临床指导用药等方面至关重要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法，通过将探针药物、测试药物与含有所述人细胞色素P450的微粒体共同孵育后，检测探针药物的代谢产物，可有效的检测药物对人细胞色素P450的抑制作用，为工业上药物的研发、筛选、和临床上用药指导提供一种便利的方法。本专利技术所述检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法，步骤包括 步骤1，选择人细胞色素P450的探针药物，将测试药物、探针药物与含所述人细胞色素P450的微粒体共同孵育； 步骤2，孵育结束后，检测探针药物在其特异性亚酶的作用下转化生成代谢产物的量，代谢产物生成量越大，则测试药物对所述人细胞色素P450抑制作用越小。本专利技术所述的方法中，以未加测试药物组酶的活性为100%，然后检测加入测试药物后生成代谢产物的量，与未加测试药物组进行对比。优选地，检测加入浓度梯度组所述测试药物后探针药物的代谢产物的量。本专利技术上述的方法中，还可以包括步骤3，将加入浓度梯度组测试药物后测得的探针药物代谢产物生成速率与测试药物浓度之间按照非线性回归作图，和/或计算半数抑制浓度IC5tl ; IC5tl值越小代表抑制作用越强。本专利技术所述的人细胞色素P450可以是其任意亚型(特异性酶)，人细胞色素P450亚型优选自CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4中的任意一种或其任意组合。本专利技术所述含人细胞色素P450的微粒体优选为人肝微粒体。本专利技术上述的方法中，所述亚型CYP1A2的探针药物为非那西丁、CYP2C9的探针药物为双氯芬酸、CYP2C19的探针药物为s-(+)美芬妥英、CYP2D6的探针药物为右 美沙芬、CYP3A4的探针药物为咪达唑仑和睾酮中的任意一种或其混合物。其中，所述探针药物的代谢产物可以是一种或几种，并且优选为检测如下代谢产物非那西丁的代谢产物包括对乙酰氨基酚、双氯芬酸的代谢产物包括4-羟基双氯芬酸、s-(+)美芬妥英的代谢产物包括4-羟基美芬妥英、右美沙芬的代谢产物包括去甲右美沙芬(右啡烷)、咪达唑仑的代谢产物包括P -羟基咪达唑仑、和睾酮的代谢产物包括6 β -羟基睾酮。本专利技术上述方法中，所述孵育体系优选为终体积为150μ I的肝微粒体体外孵育体系包括微粒体、pH值为7. 4的磷酸缓冲液、MgCl2、探针药物和测试药物。其中，微粒体蛋白浓度优选为O. Ol^lmg/ml,更优选为O. 02、· 8mg/ml,更优选为O. 05 O. 5mg/ml,如 O. lmg/ml、O. 2mg/ml、O. 3mg//ml。其中，所述孵育时间优选为I 60min,更优选为2 50min,如5min、10min、20min、30min、40mino其中，所述探针药物浓度优选为O. 5 ΙΟΟμπιοΙ/L，更优选为f80ymol/L，如2.5 μ mol/L、5 μ mol/L、10 μ mol/L、20 μ mol/L、30 μ mol/L、40 μ mol/L、50 μ mol/L。其中，所述孵育过程中，还加入再生系统，所述再生系统优选为包括G-6-P (浓度5mM)、NADP+ (浓度 ImM)和 G-6-PDH (浓度 lunit/ml)的 NADPH 再生系统。其中，孵育体系中，溶剂可以包括有机溶剂、水，有机溶剂体积百分比优选控制在5%范围内，更优选控制在2%范围内，更优选控制在1%范围内。其中，所述孵育结束包括用含内标的溶液终止反应，离心分离，取上清。所述内标优选为维拉帕米、美洛昔康中的一种或其组合，其在所述含内标的溶液中的浓度优选为 5 50nM，如 10nM、25nM、100nM、200nM。所述含内标的溶液，溶剂优选为乙腈。所述离心优选为涡旋震荡l(T60s (如20s、30s、50s)后，12000X g离心5 30min，优选为 10 20min,如 12 min、15min、17min。其中，所述在后续代谢产物检测前，上清液可以进行稀释，如I :1稀释。本专利技术上述方法中，所述代谢产物量的测定，可以采用本领域任意已知的方法，如质谱、色谱(包括气相色谱、液相色谱、高效液相色谱)、色谱/质谱联用。本专利技术上述方法中，所述测试药物可以是任意的代谢性药物，如大内环酯类药物、抗真菌药物、Hl受体拮抗剂、H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、抗抑郁剂、安定药、HMG-CoA还原酶抑制剂等。本专利技术提供的检测药物对人细胞色素P450抑制作用的检测方法，能够帮助人们掌握各种药物代谢的酶学基础、结构特征、代谢途径、与肝药酶的结合和催化能力、药酶的底物、诱导剂和抑制剂等，从而帮助筛选出合适的药物、或者判断药物是否适用，避免和降低代谢性药物相互作用的发生，因此，本专利技术所提供的方法具有显著的社会效益和经济效.、Mo附图说明图I为三种孵育时间下，不同微粒体蛋白浓度代谢产物形成的量，其中，图IA为非那西丁作为CYP1A2的探针药物、图IB为双氯芬酸作为CYP2C9的探针药物、图IC为s_(+)美芬妥英作为CYP2C19的探针药物、图ID为右美沙芬作为CYP2D6，图IE为睾酮作为CYP3A4 探针药物，图IF为咪达唑仑作为CYP3A4探针药物； 图2为三种微粒体蛋白浓度下，不同孵育时间代谢产物形成的量，其中，图2A为非那西丁作为CYP1A2的探针药物、图2B为双氯芬酸作为CYP2C9的探针药物、图2C为s_(+)美芬妥英作为CYP2C19的探针药物、图2D为右美沙芬作为CYP2D6，图2E为睾酮作为CYP3A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法，其特征在于，步骤包括：步骤1，选择人细胞色素P450的探针药物，将测试药物、探针药物与含所述人细胞色素P450的微粒体共同孵育；步骤2，孵育结束后，检测探针药物在其特异性亚酶作用下转化生成代谢产物的量，代谢产物生成量越大，则测试药物对所述人细胞色素P450抑制作用越小。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭澄，韩永龙，李丹，余奇，万丽丽，
申请(专利权)人：上海市第六人民医院，
类型：发明
国别省市：