弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用，主要解决对空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选效能不够直观的技术难题。本发明专利技术技术方案：弯曲菌分离、鉴定的试剂盒，包括：选择性增菌液Ⅰ、选择性增菌液Ⅱ、改良卡尔马里琼脂平板、哥伦比亚血平板、微需氧产气袋、革兰染色液、氧化酶试剂、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂；利用选择性分离培养基对应生长的弯曲菌典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用，弯曲菌属中包括空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌等弯曲菌的同步分离和鉴定方法，利用选择性分离培养基对应生长的弯曲菌典型菌落形态、简易生化和特异性酶-底物反应组合试验鉴定空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌在内的其他弯曲菌的试剂盒和使用方法。
技术介绍
弯曲菌属目前有30多个种，广泛寄生在自然界中的飞鸟和养殖的禽、畜动物中的肠道(结肠或空肠部位)，长期定殖并随排泄物污染环境和食品，其中的空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌属于已知的禽、畜动物类肉类制品明确检疫的病 原菌，同时，也是能引起食源性传播和暴发的重要病原菌之一。国内的许多实验室(包括临床实验室和公共卫生实验室)在实际工作中无法通过可选择的常规微生物分离方法和材料达到分离空肠弯曲菌等弯曲菌的预期效果，反而受制于弯曲菌微需氧的苛氧条件、标准菌株不易保存和选择性培养基的批间质控要求繁琐、敏感性和特异性低以及缺少简单有效的对疑似菌落筛选方法和依赖鉴定用自动化生化反应试剂材料所需的昂贵费用，既费工又费时。本专利技术是基于传统细菌学技术简化，经提炼、加入创新材料组合成的检测程序，包括对多种复杂样品的预处理和增值，使用选择性平板的筛选、甄别包括空肠弯曲菌在内的所有弯曲菌的典型菌落，结合简易快速鉴别方法和特异性酶-底物反应组合试验在2个培养周期内鉴定空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术必须依赖自动化生化鉴定仪器或分子生物学为主的方法更具有易学、综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点。适用粪便(或者粪便拭子)、食品、环境水样等多种标本中包括空肠弯曲菌或非空肠弯曲菌的同步分离和鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可利用弯曲菌属所有不同种细菌的生物学特性和酶反应试验鉴定的弯曲菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用。主要解决对空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌分离方法存在的漏检率高、鉴定步骤繁复且成本较高、筛选效能不够直观的技术难题。本专利技术针对多种不同类型标本分别使用可选择性增菌液或专一性分离平板配合简单的生长条件甄别模式、独特的革兰染色形态和细菌特异性呼吸酶-底物反应特征综合建立而成的一套行之有效的分离和特异性鉴别试验，达到对包括空肠弯曲菌和非空肠弯曲菌等弯曲菌的分离、筛选和准确鉴定的效果。本专利技术的技术方案为弯曲菌分离、鉴定的试剂盒及其制备方法，包括 I、选择性增菌液I (卫斯理肉汤)基础成分胰化酪蛋白胨20. Og, N, N- 二羟乙基甘氨酸缓冲液(Bicine buffer) 10. Og (sigmaB3876),氯化钠5. Og,酵母浸出物2. 5g,琼脂粉l.Og，亚硫酸铁O. 25g, Na2S2O3 O. 25g，丙酮酸钠O. 25g，蒸馏水983. 75ml。碱性高铁血红素溶液6. 25ml (每IOOml配方高铁血红素O. 32g,0. 15N氢氧化钠溶液IOOml溶解混匀后，5磅30分钟，108°C冷却备用)，10ml抗生素组合氨曲南10mg/L，两性霉素B2mg/L，万古霉素10mg/L。肉汤基础经15磅15分钟(121°C )灭菌后冷却至50°C加入高铁血红素溶液和抗生素组合液后分装225ml/瓶备用。2、选择性增菌液II :按照上述培养基分装9ml/管，备用。3、改良卡尔马里(KARMALI)琼脂平板成分活性炭4. Og，哥伦比亚琼脂基础990. 0ml，一起加热溶解经15磅15分钟(121°C)灭菌后冷却至50°C加入抗生素添加剂IOml(丙酮酸钠50. Omg，放线菌酮50. Omg，头孢哌酮16. Omg，氯化铁血红素16. Omg，万古霉素10. Omg)，调整pH至7. 2 (按冷却至25°C后测量值为标准)。倾注无菌平板置冰箱中，备用。4、哥伦比亚血平板哥伦比亚血琼脂基础950ml :特殊蛋白胨23. Og，琼脂份10. Og,氯化钠5. Og,淀粉I. Og,加蒸馏水950ml煮沸3次 后冷却后调整pH至7. 3 (按冷却至25°C后测量值为标准)经15磅15分钟(121°C)灭菌后冷却至50°C加入50ml无菌脱纤维绵羊血，混匀后倾注无菌平板置冰箱中，备用。5、微需氧产气袋成分碳酸氢钠8. Og,活性炭3. Og,枸橼酸2. Og,铁粉7g，无水硫酸铜I. 5g，硅藻土 10g，均匀干燥脱水后置锡纸袋内，真空封口，预计产气量为2. 5-3. 5升。使用方法取剪刀在袋口 1/3处斜开一小口，加入IOml蒸馏水后之置入容量为3. 5升或7升的乐扣乐扣(L0CK-L0CK)密封盒中，加盖密封盒体后放入42°C培养。6、革兰染色液革兰染色液I液即结晶紫取结晶紫酒精饱和液(结晶紫13. 8g溶于95%酒精IOOml内)10ml，1%草酸铵水溶液(草酸铵0. 9g溶于90ml蒸馏水)90ml，混合均匀即可；革兰染色液II液即碘酒取碘化钾2. Og溶于IOml蒸馏水中，再加碘粒l.Og，充分摇动使之溶解，再加蒸馏水300ml即可。储存于棕色瓶中备用；革兰染色液III液纯酒精液；革兰染色液IV液即复红染液(碱性复红8. 16g，溶于质量百分比浓度95%酒精IOOml内，取IOml加入质量百分比浓度5%石碳酸水溶液90ml，临用时再以蒸馏水稀释10倍)或沙黄染色液(用2. 5%沙黄酒精溶液10ml，加蒸馏水90ml)。使用方法涂片用火焰固定后，加结晶紫染液I分钟，倾去染液，加碘液染液I分钟，水洗。用酒精液脱色半分钟，快速用流水冲去染液。最后加稀释复红复染半分钟，流水冲洗干净后待自然干燥后即可镜检。结果观察革兰阳性菌呈深紫色；革兰阴性菌呈淡红色。7、氧化酶试剂成分质量百分比浓度1%对-氨基-4-甲基苯胺盐酸盐水溶液。使用方法取I片3X3cm的无菌滤纸，2次对折后将中心锐角部位与待测菌落表面接触后展开滤纸片后将氧化酶试剂直接滴加于纸片上，试剂与菌落接触扩散后立即(3秒左右)呈现红色-深红色-紫红色反应者为阳性，超过10秒后出现阳性者不作为阳性结果判断；不显色者为阴性。8、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂马尿酸纸片制备方法马尿酸钠l.Og，溶于50ml蒸馏水中(2%质量百分比浓度)，经0. 22 μ m孔径滤膜加压过滤后滴加于直径6. 35mm无菌厚纸片中，烘干备用；马尿酸酶反应试剂茚三酮溶液茚三酮3. 5g，加50ml丙酮和50ml正丁醇溶解混均后分装2. 5ml于无菌棕色滴瓶中备用。快速马尿酸水解酶试验方法取生理盐水0. Iml加于清洁小试管中，并投入马尿酸盐纸片I张，再加入50μ I经f2d培养的用被测菌的新鲜菌落或菌苔调制成的> IO1Vml浓厚菌悬液，36°C水浴2h，缓缓加入马尿酸盐试剂0. 1ml，摇匀后36°C放置5分钟，呈深紫色变化者即为阳性。快速氧化酶与马尿酸水解酶试验(阳性)是判定空肠弯曲菌的唯一依据。本专利技术的有益效果是根据多种不同类型的标本选择先进行预增菌或直接使用选择性分离平板的方式达到对标本中目的菌进行有效分离，通过选择性分离平板生长的“疑似”典型菌落接种于纯化、非选择性平板的传代，在细菌的2次传代周期内完成培养条件甄别试验、独特的革兰染色形态、氧化酶试验、马尿酸酶水解试验等简易、有效、特异、准本文档来自技高网...

【技术保护点】
弯曲菌分离、鉴定的试剂盒，包括：1）、选择性增菌液Ⅰ：基础成分：胰化酪蛋白胨20.0g，N,N？二羟乙基甘氨酸缓冲液10.0g，氯化钠5.0g，酵母浸出物？2.5g，琼脂粉？1.0g，亚硫酸铁？0.25g，Na2S2O3？0.25g，丙酮酸钠？0.25g，蒸馏水983.75ml；碱性高铁血红素溶液？6.25ml；10ml抗生素组合液：氨曲南10mg/L，两性霉素B2mg/L，万古霉素10mg/L；上述组分混合后分装225ml/瓶备用；2）、选择性增菌液Ⅱ：选择性增菌液Ⅰ分装9ml/管，备用；3）、改良卡尔马里琼脂平板：成分：活性炭4.0g，哥伦比亚琼脂基础990.0ml，抗生素添加剂10ml：丙酮酸钠50.0mg，放线菌酮50.0mg，头孢哌酮16.0mg，氯化铁血红素16.0mg，万古霉素10.0mg，上述组分混合后倾注无菌平板置冰箱中，备用；4）、哥伦比亚血平板：哥伦比亚血琼脂基础950ml：蛋白胨23.0g，琼脂粉10.0g，氯化钠5.0g，淀粉1.0g，加蒸馏水950ml煮沸3次后加入50ml无菌脱纤维绵羊血，混匀后倾注无菌平板置冰箱中，备用；5）、微需氧产气袋：成分：碳酸氢钠8.0g，活性炭3.0g，枸橼酸2.0g，铁粉7g，无水硫酸铜1.5g，硅藻土10g，均匀干燥脱水后置锡纸袋内，真空封口；6）、革兰染色液：革兰染色液Ⅰ液：结晶紫酒精饱和液10ml和1%草酸铵水溶液90ml的混合液；革兰染色液Ⅱ液：碘酒；革兰染色液Ⅲ液：纯酒精液；革兰染色液Ⅳ液：即复红染液；7）、氧化酶试剂：成分：质量百分比浓度1%对？氨基？4？甲基苯胺盐酸盐水溶液；8）、马尿酸纸片和马尿酸酶反应试剂：所述的马尿酸酶反应试剂为茚三酮溶液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许学斌，袁政安，金汇明，
申请(专利权)人：上海市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：