本发明专利技术提供一种桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，通过磁珠分离和液相色谱-质谱联用及核磁共振分析方法从桑叶中初步筛选，再制备分离或购置目标化合物，进行α-葡萄糖苷酶抑制活性验证，从而获取具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。与传统方法相比，本发明专利技术方法初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间，减少了标的化合物制备分离步骤。此外，本发明专利技术筛选方法具有快速、准确、重现性好等特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明专利技术方法获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物筛选方法领域，涉及桑叶中具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，尤其涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用及核磁共振分析技术从桑叶中获得具有α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，并在制备治疗糖尿病药物中的应用。
技术介绍
糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，其主要的干预方法是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量、药物治疗等。人体摄入的碳水化合物经过小肠上皮细胞的酶(如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶)的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收进入血液循环。阿卡波糖等 α -葡萄糖苷酶抑制剂可以抑制α -葡萄糖苷酶，减少碳水化合物转化成葡萄糖，是一类临床常用的糖尿病治疗药物。现有的α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选。亲和选择技术联用质谱分析方法可以快速分析与鉴定与特定蛋白或酶结合的配体化合物，如将特定蛋白或酶加入待筛选的样品中使用超滤膜把蛋白结合物与未结合的化合物分离开，再进行质谱检测；或是把特定蛋白或酶固定在色谱固定相中，使用洗脱溶剂把化合物按照与蛋白的结合强弱依次洗脱下来，进行质谱检测；还可将特定蛋白或酶固定在某种合适的载体上，与配体化合物作用后，把不结合的部分洗脱掉，然后把结合配体洗脱出来，进行质谱检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种桑叶中具α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，该化合物通过以下步骤实现 (I)制备键合α-葡萄糖苷酶的磁珠 Ca)磁珠活化取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入I-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30 min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗； (b)磁珠键合在活化的磁珠上，加入含α -葡萄糖苷酶的2- (N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30 min进行包被，移去上清液，再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。(2)键合磁珠质量考察将制备的键合磁珠分散在PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对α -葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像,检查磁珠键合情况,磁珠表面不粗糙、较光滑的表明键合情况良好。(3)筛选具α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物 (a)具潜在α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛取30 μ I桑叶提取物水溶液2份，分别加到Iml分散于醋酸铵溶液的键合α-葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠，放在振荡器上混匀,孵育I h。弃去上清液，再加入Iml醋酸铵溶液清洗2次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸铵溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相分析及液质鉴定，洗脱液浓缩后，用氘代二甲基亚砜(DMSO)溶解，做核磁共振氢谱分析； (b)目标化合物获取及活性验证 采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物； 采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。所述化合物为异槲皮素和紫云英苷。本专利技术的另一个目的是提供从桑叶中筛选获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物在制备抗糖尿病药物中的应用。 本专利技术通过一种快速筛选桑叶中具α -葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的方法，提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物。与传统方法相比，初筛无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间，减少了标的化合物制备分离步骤。此外，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物的快速筛选。本专利技术方法获得的具α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物可在制备抗糖尿病药物中应用。附图说明图I磁珠电镜图，A :空白磁珠，B: α-葡萄糖苷酶键合磁珠。图2桑叶磁珠结合洗脱液液相色谱图。图3桑叶磁珠结合洗脱液液相色谱-质谱图，其中图3-1和图3-2分别为峰8的光谱图与质谱图，图3-3和图3-4分别为峰10的光谱图与质谱图。图4桑叶磁珠结合洗脱液核磁共振氢谱图。具体实施例方式下面将结合附图和实施例进一步说明本专利技术的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本专利技术而非对本专利技术的限制。实施例所用仪器Finnigan LCQ Deca XPplus液质联用仪器(Finnigan公司)；Bruker Avance III 500MHz 核磁共振仪(Bruker 公司)；F200 酶标仪(Tecan 公司) 实施例I键合α-葡萄糖苷酶的磁珠制备 I.试剂及溶液配制 α_ 葡萄糖苷酶(Saccharomyces cerevisiae, simga 公司);竣基磁珠Dynabeads®MyOne Carboxylic Acid,规格10 mg/ml (invitrogen 公司);I-乙基 _3_ (3_ 二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC, sigma公司)；2_(N_吗啡啉)乙磺酸(MES, sigma公司)；N_轻基琥拍酰亚胺(NHS, sigma公司)。25 mmol/L的MES溶液配制称取MES适量，加水溶解，加lmol/L氢氧化钠溶液调pH至6,制成浓度为25mmol/L的MES溶液。50 mg/ml EDC溶液配制称取EDC适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50mg/ml的EDC溶液。临用时新鲜配制。50 mg/ml NHS溶液配制称取NHS适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50mg/ml的NHS溶液。临用时新鲜配制。lmg/ml α -葡萄糖苷酶溶液配制称取α -葡萄糖苷酶lmg，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为I mg/ml的α -葡萄糖苷酶溶液。临用时新鲜配制。2.键合α -葡萄糖苷酶的磁珠的制备 磁珠活化取300 “1磁珠，加入等体积25臟01/1的2-0-吗啡啉)乙磺酸(？!16)溶液清洗两次，每次10 min，弃去清洗液，加入50 μ I新鲜配置50 mg/ml EDC溶液和50μ I的50 mg/ml NHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30 min。孵育后，把管子放于磁铁上4 min，移除上清液，使用300 μ I 25 mmol/L MES溶液清洗两次。 磁珠键合在活化磁珠中，加入I mg/ml α -葡萄糖苷酶溶液60 μ 1，再加入25mmol/L MES溶液40 μ 1，震荡混合均匀，在室温孵育30 min，或4°C缓慢倾斜旋转孵育2 h，孵育后，把管子放于磁铁上4 min，移除上清液。加10 mmol/L PBS溶液300 μ I冲洗包被的磁珠4次，加质量分数为O. 1-0. 5 %的牛血清白蛋白PBS溶液300 μ I,震荡混合均匀，弃去上清液。3.键合磁珠质量考察将制备的键合磁珠分散在10 mmol/L PBS溶液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、α -葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像，检查磁珠键合情况。见图1，从图I可以看出，空白磁珠(A)表面非常粗糙，α-葡萄糖苷酶键合磁珠(B)表面比较光滑，表明α-葡萄糖苷酶已键合于磁珠表面。实施例本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种桑叶中具α？葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，其特征在于，通过以下步骤实现：？（1）制备键合α？葡萄糖苷酶的磁珠：（a）磁珠活化：取磁珠使用2？(N？吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1？乙基？3？(3？二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N？羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30？min后移去上清液，并用2？(N？吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；（b）磁珠键合：在活化的磁珠上，加入含α？葡萄糖苷酶的2？(N？吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀在室温孵育30？min进行包被，移去上清液，再用磷酸盐缓冲液清洗包被的磁珠，弃去清洗液，待用；（2）键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸盐缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对α？葡萄糖苷酶键合磁珠的表面分别进行扫描成像，检查磁珠键合情况，磁珠表面不粗糙、较光滑的表明键合情况良好；（3）筛选具α？葡萄糖苷酶抑制活性的化合物：（a）具α？葡萄糖苷酶抑制活性的化合物初筛：取30μl桑叶提取物水溶液2份，分别加到已分散在醋酸胺溶液的键合α？葡萄糖苷酶的磁珠和空白磁珠中，放在振荡器上混匀，孵育1？h，弃去上清液，再加入醋酸胺溶液清洗，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈的醋酸胺溶液洗脱，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相分析及液质鉴定，洗脱液浓缩后，用氘代二甲基亚砜溶解，做核磁共振氢谱分析；（b）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有α？葡萄糖苷酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：程翼宇，王毅，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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