同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法技术

本发明专利技术公开了一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，包括以下步骤：将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；向培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的复合物；本发明专利技术采用重金属胁迫提高SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力和ATP的含量，具有细胞破碎效果好，提取效率高等优势。

【技术实现步骤摘要】
同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和 ATP的方法
本专利技术涉及环境微生物
，尤其涉及一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中 SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法。
技术介绍
水中重金属离子的污染备受关注，生物吸附是一种有效去除水中重金属离子的方 法。包埋白腐真菌的复合吸附剂对水中重金属离子，例如Cd 2+、Pb2+、Cr6+等有很强的去除效 果，重金属离子对复合吸附剂微生物有毒害作用，同时微生物对重金属离子有一定的耐受 性，这与复合吸附剂的微生物的抗氧化机制和磷酸氧化机制有关。 SOD和CAT是生物体内内源性抗氧化防御系统中的主要酶，它们与自由基之间处 于一种动态平衡，当细胞处于应激状态下，体内氧化磷酸化作用增强，从而产生足够的能量 维持生命需要，但同时也导致了自由基的产生增多，导致脂质出现氧化损伤。如果测定的 SOD和CAT活性升高，说明它们清除氧自由基的能力增强，即减少自由基带来的氧化损伤。 NADH氧化酶是细胞中重要的氧代谢酶，它能够清除细胞内氧毒性，帮助细胞抗击 外界氧压力，对于维持细胞内氧平衡具有重要作用。ATP用于储存能量，当细胞需要能量时， ATP分解释放能量。当ATP的含量增大时，说明细胞需要的能量增多，此时通过调节呼吸链 和氧化磷酸化反应来增加 ATP的含量，满足细胞的供能需要。 目前有用粉碎-浸提-离心分离-超滤-浓缩-离心喷雾干燥的方法提取植物中 S0D，用CO2超临界萃取法提取动物肝脏中CAT，用离心、超声破碎法和渗透压冲击法破碎细 胞提取细菌中FMN-NADH氧化还原酶，几种传统的微生物体内ATP的提取方法有加热、超声、 酸、氯仿等。由于提取S0D、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法不尽相同，而且提取的方法复杂， 要同时提取复合吸附剂的微生物SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP就有困难。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重金属胁迫下同时提 取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，具有简单、便捷、有效、可靠 等优势，其中SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活力和ATP含量随重金属离子浓度的变化，可应用 于废水中重金属的处理。 为解决上述技术问题，本专利技术提供一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中S0D、CAT、 NADH氧化酶和ATP的方法，包括以下步骤： S1、将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白 腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液； S2、向培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出包埋白腐真菌的小球，进行液氮 研磨得到研磨样品； S3、将研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧 化酶和ATP的复合物。 进一步的，前述白腐真菌复合吸附剂包括氮修饰的二氧化钛、海藻酸钠溶液、白腐 真菌孢子悬浮液。 进一步的，前述白腐真菌孢子悬浮液为为黄孢原毛平革菌孢子液，每mL黄孢原毛 平革菌孢子悬浮液含孢子I. ox IO6个，前述海藻酸钠溶液中海藻酸钠的含量为2wt%。 进一步的，前述氮修饰的二氧化钛与前述2wt %的海藻酸钠、黄孢原毛平革菌孢子 液的质量体积比为2g : 100ml : 100ml。 进一步的，前述SI步骤具体为：制备包埋包腐真菌的小球，然后将小球加到Kirk 无机培养基中进行恒温振荡培养。 进一步的，前述振荡速度为150rpm，前述培养温度为37°C，前述培养时间为72h。 进一步的，前述S2步骤中前述Cd2+在前述培养液中的浓度为0. 1?0. 7mmol/L。 进一步的，前述S2步骤中前述胁迫培养的时间为12?14h。 进一步的，前述S3步骤中前述超声处理的功率为400w?600w，总时间3min? 5min，单次超声持续时间为2s?4s，单次超声间隔时间为8s?12s。 本专利技术的创新点在于： 本专利技术采用重金属胁迫提取白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶和 ATP，重金属镉的存在，可以增强白腐真菌复合吸附剂中的SOD、CAT、NADH氧化酶的活性，同 时ATP的含量也显著提高。但是由于白腐真菌复合吸附剂的破碎难度大，这三种酶和ATP 存在于细胞组织中，常规的提取方法并不能同时提取SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP ;同时提 取得到的SOD、CAT、NADH氧化酶的酶活性也不高。 本专利技术采用液氮研磨、磷酸缓冲液提取和超声方法联合提取白腐真菌复合吸附剂 中的SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP，其中磷酸缓冲液里能发挥这三种酶活力，而液氮研磨和 冰浴超声处理使细胞破碎更充分，都在低温条件下进行，能保持酶活性。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于： (1)本专利技术采用液氮研磨法初步提取酶和ATP，研磨速度快，细胞破碎效果好，提 取效率高。 (2)本专利技术将液氮研磨后的初提取物再用磷酸缓冲液提取，同时使用冰浴超声和 二次离心处理，能保证提取过程中是低温环境，酶和ATP处于抑制状态，不影响酶活力测定 和ATP含量的计算，且提取充分、完全。 【附图说明】 为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例 中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。 图1为本专利技术实施例1中白腐真菌复合吸附剂经0?0. 7mmol/L的Cd2+的胁迫培 养所得的体内SOD、CAT和NADH氧化酶活力变化图。 图2为本专利技术实施例2中白腐真菌复合吸附剂经0?0. 7mmol/L的Cd2+的胁迫培 养所得的体内ATP含量变化图。 【具体实施方式】 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本专利技术作进一步描述，但并不因此而 限制本专利技术的保护范围。 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中白腐真菌采用黄孢原毛平革菌 (Phanerochaete chrysosporium)BKMF_1767,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC AF96007。 实施例1 一种重金属胁迫下同时提取白腐真菌复合吸附剂中超氧化物歧化酶（SOD)、过氧 化氢酶（CAT)和还原型辅酶I氧化酶（NADH氧化酶）和ATP的方法，包括以下步骤： (1)把2g氮修饰二氧化钛加入IOOmL质量分数为2%的海藻酸钠溶液中得到混合 溶液，将IOOmL孢子数为I. 0 X IO6个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液加入到上述混合溶液 中，搅拌均匀得到白腐真菌复合吸附剂。用注射器将白腐真菌复合吸附剂滴加到200mL质 量分数为3%的CaCl 2溶液中制成包埋黄孢原毛平革菌的小球。把包埋有黄孢原毛平革菌 的小球加到Kirk无机培养基（Kirk无机培养基的组分为I. 2mmol/L的酒石酸铵，56mmol/ L 的葡萄糖，20mmol/L 的无水乙酸钠，0? 2g/L 的 KH2P04,0 . 05g/L 的 MgSO4 WH2C^O. 01g/L 的 CaCl2, lml/L的无机溶液，0. 5ml/L的维生素溶液）中进行恒温振荡培养72h，振荡培养的温 度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中，制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液；S2、向所述培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出所述包埋白腐真菌的小球，进行液氮研磨得到研磨样品；S3、将所述研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的复合物。

【技术特征摘要】
1. 一种同时提取白腐真菌复合吸附剂中SOD、CAT、NADH氧化酶和ATP的方法，其特征 在于，包括以下步骤： 51、 将白腐真菌复合吸附剂加入CaCl2溶液中，制成包埋白腐真菌的小球，将包埋白腐 真菌的小球进行恒温振荡培养得到培养液； 52、 向所述培养液中加入Cd2+进行胁迫培养，然后取出所述包埋白腐真菌的小球，进行 液氮研磨得到研磨样品； 53、 将所述研磨样品中加入磷酸缓冲液，冰浴下超声处理，离心得到SOD、CAT、NADH氧 化酶和ATP的复合物。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白腐真菌复合吸附剂包括氮修饰的 二氧化钛、海藻酸钠溶液、白腐真菌孢子悬浮液。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述白腐真菌孢子悬浮液为黄孢原毛平 革菌孢子液，每mL黄孢原毛平革菌孢子悬浮液含孢子1. 0 X 106个，所述海藻酸钠溶液中海 藻酸钠的含量为2wt%。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭琼，陈桂秋，曾光明，晏铭，陈安伟，左亚男，黄真真，郭志，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43