本发明专利技术公开了一种真菌油脂提取方法，其通过酶-超声波联用的方法酶解真菌细胞壁（即利用超声波辅助几丁质酶和蜗牛酶酶解真菌细胞壁），再加入SDS将真菌细胞进一步裂解，加入异丙醇和正戊烷进行一次或多次油脂提取。本方法工艺简单，真菌细胞破壁完全，油脂提取率高，达到95%以上。本方法所用的主要提取溶剂正戊烷沸点和气化潜热均较低，毒性低，相对于现有的真菌油脂提取方法，耗能低，环境安全性高。?
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种真菌油脂的提取方法。
技术介绍
随着化石燃料的日益减少，能源问题引起了全球的广泛关注，寻找新型可再生能源已经成为必经之路。真菌产油以其生产周期短，油脂含量高，可以利用多种废弃物发酵产油，不与人类争粮，生产成本低，安全环保等优势特点，具有广泛的开发应用潜力。 产油真菌一般将油脂贮藏在胞内，因此，在油脂提取过程中，必须先将真菌细胞进行破壁处理，将油脂释放到胞外，才可以用溶剂进行油脂提取，因此真菌细胞的破壁程度，对真菌油脂的提取率有很大的影响。真菌的破壁方法较多：液氮研磨，反复冻融，超声波，酸热法，菌体自溶和酶解法等。单一的使用某种破壁方法，其破壁效果一般不好，因此，需将几种破壁方法联合使用，以提高破壁效果。 目前微生物油脂的提取方法已申请相关专利，比如：201010593183.4 号专利技术专利公开了一种微生物油脂的提取方法，以产油微生物发酵醪液为原料，经过酶解、有机溶剂浸提得到微生物油脂。该方法通过直接在发酵液中添加酶进行细胞破壁，酶的用量较大，成本较高；且单一的酶解破壁，不与其他方法联用，其细胞破壁率较低，且耗时较长。且其所用萃取溶剂的沸点和气化潜热均较高，因此，在油脂提取和有机溶剂回收过程中所需温度相对较高，能耗较大。201210511744.0号专利技术专利公开了一种微藻油脂的提取方法，通过在超声波场条件下用反复冻融的方法破碎细胞壁，然后利用特定比例的有机溶剂混合物萃取油脂。该方法通过在超声波场中反复冻融的方法进行细胞破壁，细胞破壁耗时较长，而且破壁率不高，这将影响后续的油脂提取效率。
技术实现思路
针对上述现有的技术问题，本专利技术提供了一种工艺简单、能耗低、效率高的真菌油脂提取方法。 为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下： 一种真菌油脂提取方法：其特征在于，所述方法包括下列步骤 ：（1）菌体培养；（2）菌体收集：通过离心机对真菌培养液进行离心，收集真菌湿菌体；（3）菌体细胞壁酶解：将收集到的湿菌体溶解于酶解缓冲液中，加入几丁质酶和蜗牛酶将细胞壁酶解，同时加超声波辅助酶解，形成菌体酶解液；（4）菌体细胞裂解：向菌体酶解液中加入SDS溶液进一步裂解细胞，获得菌体细胞裂解液；（5）有机溶剂提取：向菌体细胞裂解液中加入异丙醇提取一段时间后，再加入正戊烷进行一次或多次提取，每次加入正戊烷提取后离心收集上层正戊烷层，整个提取过程中加超声波辅助提取；（6）回收有机溶剂：合并有机溶剂提取后所得的正戊烷层，回收有机提取剂，得到真菌油脂。 进一步，所述步骤（2）中离心机的离心速率为2000~6500rpm，离心时间为5~40min。 进一步，所述步骤（3）中的酶解缓冲液为：山梨酸0.5~2mmol/L，CaCl2 5~20mmol/L，EDTA 0.05~0.2mmol/L，pH5.0~8.0。 进一步，所述步骤（3）中酶解缓冲液的加入量为2~20mL/g湿菌体。 进一步，所述步骤（3）中几丁质酶的加入量为50~800U/g湿菌体，蜗牛酶的加入量为100~1500U/g湿菌体，酶解温度为20~70℃，酶解时间为15~60min；辅助酶解的超声波功率为100~300W，频率为25~40kHz。 进一步，所述步骤（4）中SDS溶液浓度为0.1~0.25mol/L，加入量为2~20mL/g湿菌体，反应温度为30~70℃，反应时间为2~10min。 进一步，所述步骤（5）中异丙醇的加入量为5~20mL/g湿菌体，异丙醇的提取温度为15~60℃，提取时间为0.5~4min。 进一步，所述步骤（5）中正戊烷提取次数为1~6次，正戊烷的初次加入量为8~30mL/g湿菌体，正戊烷用量以初次加入量为准依次减少1~3mL/g湿菌体；提取温度为15 ~35℃，每次提取时间为1~10min。 进一步，所述步骤（5）中辅助提取超声波功率为200~600W，频率为30~60kHz。 本专利技术的有益效果：油脂提取率高：本专利技术在真菌破壁预处理过程中，采用酶-超声波联用的方法，提高了酶的活性，从而增加了真菌细胞的破壁效率；再加入SDS溶液裂解细胞，进一步增加了真菌细胞的破碎程度，从而使得真菌的油脂提取率达到95%以上。节能环保：本方法所用的主要萃取溶剂正戊烷沸点和气化潜热均较低，毒性低，相对于现有的真菌油脂提取方法，耗能低，环境安全性高。操作简单：不需要特殊的仪器设备，样品处理量大，适合大规模的工业化生产使用。附图说明图1为本专利技术一种真菌油脂提取方法的流程图。具体实施方法 下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步的描述。 菌体的实际油脂含量的测定方法参照油脂提取的经典方法（Bligh E.G.，Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology，1959，37(8): 911-917），该方法普遍用于真菌油脂的提取，结果准确，与样品的实际含油量十分接近。因此，将该方法的油脂提取率设定为100%，计算其他方法的油脂提取率。实施例1 参考文献（李永红等，广谱碳源产油酵母菌的筛选. 中国生物工程杂志，2005，25（12）：39-44）所述产油酵母的培养方法，培养红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides（中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号AS2.1389），4000rpm/min离心15min，收集湿菌体，经典方法测得干燥菌体的油脂含量为52.6%。 参照附图1所示的一种真菌油脂提取方法，包括以下步骤:（1）菌体培养：培养红冬孢酵母（与上述参考文献中产油酵母的培养方法相同）；（2）菌体收集：通过离心机对真菌培养液进行离心，收集20g真菌湿菌体，离心速率4000rpm/min离心15min；（3）菌体细胞壁酶解：将收集到的湿菌体溶解于酶解缓冲液中，所述酶解缓冲液为山梨酸1mmol/L，CaCl210mmol/L，EDTA 0.1mmol/L的混合液，加入量200ml， pH6.5，加入1g几丁质酶（0.8万U/g）和1.6g蜗牛酶（1万U/g）将细胞壁酶解，同时加功率为200W，频率为30kHz超声波辅助酶解，温度45℃酶解30min，形成菌体酶解液；（4）菌体细胞裂解：向菌体酶解液中加入160 mL0.2 mol/L SDS溶液进一步裂解细胞，温度55℃裂解5min，获得菌体细胞裂解液；（5）有机溶剂提取：向所得菌体细胞裂解液中加入200mL异丙醇，充分混匀，温度45℃条件下提取1min，重复加入正戊烷，进行3次提取，首次加入量为300mL，后2次每次依次减少40mL，充分混匀，温度33℃条件本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种真菌油脂提取方法：其特征在于，所述方法包括下列步骤 ：
（1）菌体培养；
（2）菌体收集：通过离心机对真菌培养液进行离心，收集真菌湿菌体；
（3）菌体细胞壁酶解：将收集到的湿菌体溶解于酶解缓冲液中，加入几丁质酶和蜗牛酶将细胞壁酶解，同时加超声波辅助酶解，形成菌体酶解液；
（4）菌体细胞裂解：向菌体酶解液中加入SDS溶液进一步裂解细胞，获得菌体细胞裂解液；
（5）有机溶剂提取：向菌体细胞裂解液中加入异丙醇提取一段时间后，再加入正戊烷进行一次或多次提取，每次加入正戊烷提取后离心收集上层正戊烷层，整个提取过程中加超声波辅助提取；
（6）回收有机溶剂：合并有机溶剂提取后所得的正戊烷层，回收有机溶剂，得到真菌油脂。
2.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中离心机的离心速率为2000~6500rpm，离心时间为5~40min。
3.根据权利要求1所述的真菌油脂提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中的酶解缓冲液为：山梨酸0.5~2mmol/L，CaCl2 5~20mmol/L，EDTA 0.05~0.2mmol/L，pH5.0~8.0。
4.根根据权利要求3所述的真菌油脂提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中酶解缓冲液的...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡燕花，陈集双，张本厚，
申请(专利权)人：南京工业大学大丰海洋产业研究院，
类型：发明
国别省市：
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