一种提取土壤微生物总DNA的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及微生物领域，公开了一种提取土壤微生物总DNA的方法及其在土壤微生态分析中的应用，所述方法包括土壤微生物细胞破碎处理、DNA纯化处理和DNA溶解处理，其中，在土壤微生物细胞破碎处理之前对土壤进行预处理，所述预处理包括用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤。本发明专利技术的提取土壤微生物总DNA的方法，可以有效地提取土壤微生物的总DNA，且产物产量大、纯度高，能够满足各类后续操作要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物领域，具体地，涉及一种提取土壤微生物总DNA的方法及其在土壤微生态分析中的应用。
技术介绍
传统的土壤微生态分析大多是通过对土壤中的微生物进行分离培养，观察其生长性状和生理生化性质。然而，由于土壤中有高达99％-99.9％的微生物难以分离培养，这种传统方法具有较大局限性。因此人们提出了微生物分子生态学技术，直接使用分子手段研究土壤的微生态。而微生物分子生态学应用于土壤微生态研究的关键的一个步骤就是从土壤中提取微生物总DNA。土壤微生物总DNA的提取，主要的难题在于土壤颗粒可能紧密吸附微生物菌体或DNA，导致提取困难；同时土壤中含有大量腐殖酸、酚类、重金属离子等杂质，直接影响后续的PCR、酶切等操作。一般土壤微生物总DNA的提取包括物理法(如冻融、研磨、超声破碎等)，化学法(如使用表面活性剂等)和生物法(如使用溶菌酶、蛋白酶等)。各种方法均具有不同的优点和缺点，将其结合是目前主流的研究方向。目前，已经有报道了高温裂解法、SDS-CTAB裂解法、酶裂解法等方法进行土壤微生物总DNA的提取，亦有商业化试剂盒上市。然而这些方法得到的DNA产量较小，且杂质移除率不能满足需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的方法提取得到的DNA产量较小、纯度较低的缺陷，提供一种提取土壤微生物总DNA的方法及其在土壤微生态分析中的应用。本专利技术的方法可以有效地提取土壤微生物的总DNA，且产物产量大、纯度高，能够满足各类后续操作要求。本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，在提取土壤微生物总DNA时，通过采取在土壤微生物细胞破碎处理之前对土壤进行包括用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤的预处理的方式，能够显著提高得到的DNA的产量和纯度。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种提取土壤微生物总DNA的方法，所述方法包括土壤微生物细胞破碎处理、DNA纯化处理和DNA溶解处理，其中，在土壤微生物细胞破碎处理之前对土壤进行预处理，所述预处理包括用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤。第二方面，本专利技术提供了上述方法在土壤微生态分析中的应用。本专利技术的提取土壤微生物总DNA的方法，可以有效地提取来自不同性质土壤的微生物的总DNA，且产物产量大、纯度高，能够满足包括PCR在内的各类后续操作要求。本专利技术的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。第一方面，本专利技术提供了一种提取土壤微生物总DNA的方法，该方法包括土壤微生物细胞破碎处理、DNA纯化处理和DNA溶解处理，其中，在土壤微生物细胞破碎处理之前对土壤进行预处理，所述预处理包括用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤。本专利技术方法中，对于预处理中用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤的顺序没有特别的要求，可以为先用偏磷酸钠溶液洗涤土壤，然后再用异丙醇洗涤土壤，也可以为先用异丙醇洗涤土壤，然后再用偏磷酸钠溶液洗涤土壤。为了进一步提高提取得到的DNA的产量和纯度，优选情况下，预处理中先用偏磷酸钠溶液洗涤土壤，然后再用异丙醇洗涤土壤。本专利技术方法中，在用偏磷酸钠溶液洗涤土壤时，对于偏磷酸钠溶液的浓度和pH没有特别的限定，可以为本领域常用的各种浓度和pH，优选情况下，偏磷酸钠溶液的浓度为15-25g/L，pH为8-9。本领域技术人员应该理解的是，本专利技术方法中所用的偏磷酸钠溶液中溶质仅为偏磷酸钠，不包括其他成分，如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。本专利技术方法中，在用偏磷酸钠溶液洗涤土壤时，对于偏磷酸钠溶液的用量没有特别的限定，只要能够利用偏磷酸钠溶液对土壤进行洗涤即可，优选情况下，相对于每克土壤，偏磷酸钠溶液的用量为2-6mL。本专利技术方法中，在用偏磷酸钠溶液洗涤土壤时，为了进一步提高提取得到的DNA的产量和纯度，优选情况下，用偏磷酸钠溶液洗涤土壤的次数为2-4。本专利技术方法中，在用偏磷酸钠溶液洗涤土壤时，优选情况下，用偏磷酸钠溶液洗涤土壤的方式包括：在土壤中加入偏磷酸钠溶液，搅拌均匀后离心取沉淀。对于离心的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种离心条件，例如可以为在10000-13000rpm下室温离心8-12min。本专利技术方法中，在用异丙醇洗涤土壤时，对于异丙醇的用量没有特别的限定，只要能够利用异丙醇对土壤进行洗涤即可，优选情况下，相对于每克土壤，异丙醇的用量为1-3mL。本专利技术方法中，为了进一步提高提取得到的DNA的产量和纯度，优选情况下，用异丙醇洗涤土壤的次数为2-4。本专利技术方法中，优选情况下，用异丙醇洗涤土壤的方式包括：在土壤或沉淀(例如经偏磷酸钠溶液洗涤土壤后得到的沉淀)中加入异丙醇，搅拌均匀后离心取沉淀。对于离心的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种离心条件，例如可以为在10000-13000rpm下室温离心8-12min。本专利技术方法中，为了进一步提高提取得到的DNA的产量和纯度，优选情况下，所述预处理还包括用Crombach缓冲液洗涤土壤。本专利技术方法中，对于预处理中用偏磷酸钠溶液洗涤土壤、用Crombach缓冲液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤的顺序没有特别的要求，可以以任何顺序洗涤土壤。为了进一步提高提取得到的DNA的产量和纯度，优选情况下，预处理包括依次用偏磷酸钠溶液、Crombach缓冲液和异丙醇洗涤土壤。本专利技术方法中，在用Crombach缓冲液洗涤土壤时，对于Crombach缓冲液的pH、组分及浓度没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种pH、组分和浓度，优选情况下，Crombach缓冲液包括Tris-HCl和EDTA-Na2，Tris-HCl的浓度为0.03-0.04mol/L，EDTA-Na2的浓度为0.0005-0.0015mol/L，Crombach缓冲液的pH为7.5-8.5。本专利技术方法中，在用Crombach缓冲液洗涤土壤时，对于Crombach缓冲液的用量没有特别的限定，只要能够利用Crombach缓冲液对土壤进行洗涤即可，优选情况下，优选地，相对于每克土壤，Crombach缓冲液的用量为2-6mL。本专利技术方法中，在用Crombach缓冲液洗涤土壤时，为了进一步提高提取得到的DNA的产量和纯度，优选情况下，用Crombach缓冲液洗涤土壤的次数为2-4。本专利技术方法中，在用Crombach缓冲液洗涤土壤时，优选情况下，用Crombach缓冲液洗涤土壤的方式包括：在土壤或沉淀中加入Crombach缓冲液，搅拌均匀后离心取沉淀。对于离心的条件没有特别的限定，可以为本领域常用的各种离心条件，例如可以为在10000-13000rpm下室温离心8-12min。本专利技术方法中，对于土壤微生物细胞破碎处理的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种土壤微生物细胞破碎处理方法，优选情况下，土壤微生物细胞破碎处理包括：在预处理得到的样品中依次加入DNA提取缓冲液、溶菌酶和蛋白酶K进行处理。本专利技术方法中，对于DNA提取缓冲液的组分及其用量、溶菌酶的用量和蛋白酶K的用量没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种组分和用量，此为本领域技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取土壤微生物总DNA的方法，所述方法包括土壤微生物细胞破碎处理、DNA纯化处理和DNA溶解处理，其特征在于，在土壤微生物细胞破碎处理之前对土壤进行预处理，所述预处理包括用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤。

【技术特征摘要】
1.一种提取土壤微生物总DNA的方法，所述方法包括土壤微生物细胞破碎处理、DNA纯化处理和DNA溶解处理，其特征在于，在土壤微生物细胞破碎处理之前对土壤进行预处理，所述预处理包括用偏磷酸钠溶液洗涤土壤和用异丙醇洗涤土壤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预处理还包括用Crombach缓冲液洗涤土壤，优选地，所述预处理包括依次用偏磷酸钠溶液、Crombach缓冲液和异丙醇洗涤土壤。3.根据权利要求1所述的方法，其中，用偏磷酸钠溶液洗涤土壤的次数为2-4。4.根据权利要求1所述的方法，其中，用异丙醇洗涤土壤的次数为2-4。5.根据权利要求2所述的方法，其中，用Crombach缓冲液洗涤土壤的次数为2-4。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述偏磷酸钠溶液的浓度为15-25g/L，pH为8-9；优选地，相对于每克土壤，所述偏磷酸钠溶液的用量为2-6mL。7.根据权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：林森，朗喆，任立伟，王培红，
申请(专利权)人：粮华生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11