一种提取DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA提取方法以及基于所述提取方法的DNA文库构建方法和高通量测序方法。所述DNA提取方法可有效提取微量、已降解成小片段和/或被污染的DNA，从而使得之后DNA建库和测序能够顺利进行，最终获取其序列信息。

【技术实现步骤摘要】
一种提取DNA的方法
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及提取超微量和/或被污染和/或高度降解的DNA的方法。
技术介绍
高通量测序(又称新一代测序、二代测序，Next-generationsequencing)可以一次性测定大量核酸序列，被广泛用于基因组、转录组研究，并在医学、法医等领域也获得诸多应用。高通量测序的基本原理是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列并进行PCR(称为“建库”过程)，然后使用Illumina,IonTorrent等测序仪进行测序(M.L.Metzker,Sequencingtechnologies—thenextgeneration,Naturereviews.Genetics11,31–46(2010))。但全面测定基因组信息需要较多的DNA量作为起始来进行建库，通常不少于100ng。当DNA的量低于这一量时，建库效率急剧降低，以致无法进行测序。为了解决超微量样品的测序问题，人们研究了所谓的“单细胞测序”(single-cellsequencing)技术，即采用几百、几十个甚至单个细胞内提取出的DNA作为起始DNA来进行测序。目前所有的单细胞测序技术都基于全基因组扩增方案，使用模板依赖性的DNA聚合酶(多用Phi29DNA聚合酶)对单个基因组DNA分子进行扩增，从而使DNA量满足测序建库的起始量要求。目前主要应用的实施方案分为多重置换扩增(MDA)、单引物等温扩增(SPIA)、MALBAC三大类(Dean,F.B.等人，“Comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification,”ProcNatlAcadSciUSA,99:5261-6,2002；KurnN等人，Novelisothermal,linearnucleicacidamplificationsystemsforhighlymultiplexedapplications,ClinChem,51(10):1973-81,2005；Zong,C等人，“Genome-widedetectionofsingle-nucleotideandcopy-numbervariationsofasinglehumancell,”Science,338:1622-6,2012)。考虑到一个人细胞基因组DNA大约为3.5pg，MDA和MALBAC都已实现对单细胞基因组DNA扩增，而SPIA需要的最低起始量为1ng(约300个人细胞)。但这些单细胞测序技术都有着共同的局限性，主要体现在两点：(1)要求较长的DNA连续片段；(2)对污染DNA极端敏感。而这两点往往在实际应用中难以保证。实际医学应用中从冰冻切片、石蜡包埋切片中提取的DNA往往已被打断，法医应用中从高度腐烂尸体中提取的DNA也早已降解成小片段(根据保存条件的不同，可降解成20～500bp小片段)，因而难以使用全基因组扩增方案。同时，提取出的DNA样本中往往混有数量可观的微生物DNA的污染，在操作时也极易被环境中的微生物所污染，若使用全基因组扩增方案，优先扩增的将是污染的微生物DNA，致使最后测序结果中绝大部分序列都是污染的微生物DNA。此外，超微量建库方法还常常遇到的挑战是DNA的提取。在传统的DNA提取方案中(包括基于酚-氯仿体系的提取方案和基于硅吸附的提取方案)，均使用乙醇或其类似物对DNA进行洗涤和沉淀，而DNA微溶于乙醇及其类似物。当DNA量极微的时候，DNA可能全部溶于乙醇而损失。若加入糖原等物质帮助沉淀，糖原会一同沉淀下来，可能干扰一些后续反应；若加入carrierDNA(如在人的微量DNA样品中加入大量细菌、酵母等DNA)帮助沉淀，会人为引入污染，虽然对普通单基因PCR实验没有影响，但会严重影响高通量测序的结果，致使最后测序结果中绝大部分序列都是carrierDNA。综上所述，本领域中存在对于能够有效提取极微量DNA、高度降解的DNA和/或被污染的DNA的方法的需要。
技术实现思路
鉴于上述问题，提出了本专利技术，以便提供一种提取DNA的方法，以克服上述问题或者至少部分地解决上述问题。在第一方面，本专利技术提供一种DNA提取方法，所述方法包括在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA。在第二方面，本专利技术提供一种DNA文库构建方法，所述方法包括采用第一方面所述的方法进行DNA提取。本专利技术的DNA文库构建方法可以包括：(1)在所述生物样品中加入环状DNA；(2)提取所述生物样品中的DNA；(3)将所提取的DNA与接头序列连接，之后进行PCR扩增；和(4)通过凝胶电泳分离扩增后的DNA片段，完成文库构建。本专利技术的DNA文库构建方法还可以包括：步骤(2)和步骤(3)之间进行步骤(2’)：对所述DNA进行末端修复。在本专利技术的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以为其中DNA高度降解和/或被污染的样品和/或微量样品。在本专利技术的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以包含已降解至30-40bp的DNA片段。在本专利技术的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，其中所述环状DNA的长度可以大于所述生物样品中最长DNA片段的长度至少500bp-20kb和/或所述环状DNA的长度可以小于所述生物样品中最短DNA片段的长度至少500bp-1000bp。。在本专利技术的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述环状DNA可以为细菌质粒DNA，优选地可以为高纯度的细菌质粒DNA。在本专利技术的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述细菌环状质粒DNA可以通过柱式质粒提取试剂盒提取。在本专利技术的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以为动物生物样品、微生物生物样品或植物生物样品。在第三方面，本专利技术提供了一种高通量测序方法，所述方法采用第二方面所述的方法进行DNA文库构建。在本专利技术的方法中，适合的环状DNA与所构建的目标DNA文库乃至后续测序步骤中所使用的测序仪有关，可根据需要选用不同大小的环状DNA，只要所述环状DNA与所构建的目标DNA文库能够有效分离即可。例如，Illumina和iontorrent测序仪只能测较短的DNA文库(50～1000nt)，于是适合的环状DNA大小一般应在1.5kb以上，而PacBio和MinION测序仪主要测序较长的DNA文库(3kb～30kb)，因此适合的环状DNA大小一般应在2.5kb以下或40kb以上。最常见、也最容易制备的高质量环状DNA是细菌的质粒，其大小通常为1.5kb～9kb。也可用线粒体基因组(约17kb)和细菌基因组(一般1～10Mb)。本专利技术的有益效果在于：(1)可有效提取微量、已降解成小片段的DNA，从而使得之后DNA建库和测序能够顺利进行，最终获取其序列信息。(2)即使样品中混有大量微生物(或其他异种生物)基因组污染，也可不受干扰地进行建库和测序，这对处理一些已受污染的样品(如病人血液、法医应用中埋藏于野外的高度腐烂的尸体等)特别有用。(3)可极大降低对实验环境洁净度和操作人员熟练程度的要求。即便实验环境中存在其他生物污染(如空气中漂浮的细菌、真菌孢子、植物花粉等)，待测微量DNA也可不受影响地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA提取方法，所述方法包括在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA。

【技术特征摘要】
1.一种DNA提取方法，所述方法包括在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品为其中DNA被高度降解的样品和/或被污染的样品和/或微量样品。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品中的DNA片段包括已降解至30-40bp的DNA片段。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述环状DNA的长度比所述生物样品中最长DNA片段的长度大500bp-20kbp和/或所述环状DNA的长度比所述生物样品中最短DNA片段的长度小500bp-1000bp。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述环状DNA为细菌环状质粒DNA。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述细菌环状质粒DNA通过柱式质粒提取试剂盒提取。7.一种DNA文库构建方法，所述方法包括：(1)在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA；(2)提取所述生物样品中的DNA片段；(3)将所提取的DNA片段与接头序列连接，之后进行PCR扩增；和(4)通过凝胶电泳分离扩增后的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张弓，
申请(专利权)人：深圳承启生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44