一种荒漠植物总DNA的提取方法技术

本发明专利技术提供一种荒漠植物总DNA的提取方法，步骤如下：（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到样品粉末；（2）在样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取沉淀物；（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；（4）取上清，加入酚/氯仿/异戊醇混匀，抽提，离心；（5）取上清，加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀DNA 30-60min；（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；（7）收集沉淀，加入灭菌水溶解。本发明专利技术的方法操作简单，耗时短，DNA损失少，产量高，纯度高，完整性好，适用性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物分子生物学
，具体涉及一种荒漠植物总DNA的提取方法。
技术介绍
由于荒漠植物体内含有大量的多糖、多酚、单宁酸和其它次级代谢物，因此荒漠植物具有强抗逆性，现代分子生物学技术的运用对揭示荒漠植物强抵抗逆境的机制及其遗传种质资源的保护具有重要的作用，检测不同环境胁迫下基因表达水平的变化为理解植物的抗逆性提供一些必要的基础数据，高质量DNA的提取是进行分子生物学基因表达研究的必要前提。目前提取DNA的方法有多种，包括异CTAB法、SDS法、沸水浴法、月桂酸提取法。然而，已经发表的大量文章都反映出在分离高质足量的DNA存有不同的困难，主要表现在：植物组织细胞破碎后，释放出大量的多酚、多糖以及其它次级代谢物而干扰DNA的提取；多酚易氧化成多醌而与核酸结合；多糖在低离子浓度缓冲溶液中与DNA结合产生共沉淀。这些都导致DNA产量降低。这样，不同植物组织中多糖、多酚以及其它次级代谢物含量的不同显著地影响着核酸的抽提及纯化过程，因此研究荒漠植物抗逆机制、DNA提取方法是科技工作者必须解决的一个技术难题。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种荒漠植物总DNA的提取方法。本专利技术提供一种荒漠植物总DNA的提取方法，步骤如下：（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到样品粉末；（2）在步骤（1）得到的样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取沉淀物；所述前处理缓冲液的配方为：200mMTris-HCl+50mMEDTA+250mMNaCl+0.5-2%β巯基乙醇；（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；所述提取裂解液的配方为：2%CTAB（W/V）+1.4MNaCl+0.02MEDTA+0.1MTris-HCl+0.2-0.5%β巯基乙醇（V/V）；pH=8.0；（4）取上清，加入酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1）混合液混匀，抽提，离心；（5）取上清，加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀DNA30-60min；（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；（7）收集沉淀，加入灭菌水溶解。作为优选，步骤（1）中所述荒漠植物样品的加入量为0.2g-1.0g。该加入量植物样品最少取样量，最适合萃取体积，保证获得最大量DNA提取物。作为进一步优选，步骤（2）中所述样品粉末与前处理缓冲液的比值为0.2-1.0g：500-1000μl。作为优选，步骤（1）中所述PVPP粉的加入量为荒漠植物叶片质量的0.5-2%。作为优选，步骤（2）中所述低速离心为900rpm离心5min。低速离心分离可溶性糖类，保留植物样本内核酸。作为优选，步骤（4）中所述酚/氯仿/异戊醇混合液的加入量与上清液的体积相同。作为优选，步骤（5）中所述异丙醇的加入量为上清液体积的1/2。作为优选，步骤（6）中所述高速离心是在4℃12000rpm转速离心5-10min；所述取沉淀用乙醇清洗是用75%乙醇清洗两遍。本专利技术的优点和产生的有益效果为：1、操作简单，耗时少；操作过程大约2-3小时。2、DNA损失少，产量高；DNA产量大于500ng/μl。3、纯度高；荒漠植物富含多酚、多糖、蛋白质等次级代谢物，为了使提取的DNA纯度高，操作过程中首先在材料研磨时使用PVPP粉结合多酚进而通过氯仿／异戊醇抽提彻底去除多酚；通过使用高盐的前处理缓冲液去除大部分多糖。4、完整性好；采用改良的CTAB法提取荒漠植物DNA，不仅试验操作简单，耗时少，产量高，纯度高，而且DNA完整性好。由于改良CTAB法能彻底去除多糖、多酚、蛋白质、RNA及其它污染物，所提的DNA适合分子生物学的下游实验如反转录及基因扩增等，所以改良CTAB法是提取荒漠植物总DNA的最理想方法，为后续开展荒漠植物分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验奠定了基础。5、适用性强；本专利技术不仅能从常见荒漠植物中提取出高质量的DNA，同时也适合于其它富含多糖、多酚以及大量次级代谢物的植物DNA的高效提取，如提取水果果实、百合鳞茎中DNA，它具有广泛的应用价值。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为12种荒漠植物DNA电泳图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。一、试验准备阶段：1、植物材料挑选腾格里沙漠南缘沙坡头地区的常见荒漠植物沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王等植株，取其叶片、茎、根、花穗等组织立即冻存于液氮，贮存在-80℃冰箱备用。2、试剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四乙酸乙二胺(EDTA)、β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP6755)购自美国Sigma公司，琼脂糖（Agarose）等购自鹏程生物科技公司，其他试剂均为国产分析纯产品。3、DNA提取准备工作提取试剂配制所用容器，提取所用研钵、药匙和研杵等用高温灭菌。制备DNA的离心管、枪头等于120℃高压蒸汽灭菌20分钟后烘干备用。用于DNA电泳的电泳槽和梳子的处理：用去污剂清洗后，用水冲洗并用乙醇干燥，然后装满3％的H202溶液，室温下处理10min。操作过程中，带手套口罩，无菌超净工作台上提取，研磨迅速，避免DNA受到污染。4、提取相关溶液配置PVPP粉末：购自Sigma公司；高压灭菌锅120℃20分钟灭菌后，密封低温保存；前处理缓冲液：200mMTris-HCl+50mMEDTA+250mMNaCl+0.5-2%β巯基乙醇（V/V）；提取裂解液：2%CTAB（W/V）+1.4MNaCl+0.02MEDTA+0.1MTris-HCl+0.2-0.5%β巯基乙醇（V/V）；pH=8.0；CI纯化液：酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，（V/V，分析化学级市售有机溶剂）；异丙醇：100%纯度，分析化学级市售有机溶剂；70%乙醇（V/V），分析化学级别有机溶剂；所有溶液都用高压灭菌处理的超纯水配置，有机溶剂为国产分析级产品。本专利技术的荒漠植物叶片DNA提取方法如下：1、材料研磨...

【技术保护点】
一种荒漠植物总DNA的提取方法，其特征在于：步骤如下：（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到样品粉末；（2）在步骤（1）得到的样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取沉淀物；所述前处理缓冲液的配方为：200mM Tris‑HCl+50mM EDTA+250mM NaCl+0.5‑2%β巯基乙醇；（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；所述提取裂解液的配方为：2% CTAB（W/V）+1.4M NaCl+0.02M EDTA+0.1M Tris‑HCl+0.2‑0.5%β巯基乙醇（V/V）；pH=8.0；（4）取上清，加入酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1）混合液混匀，抽提，离心；（5）取上清，加入预冷的异丙醇，‑20℃沉淀DNA 30‑60min；（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；（7）收集沉淀，加入灭菌水溶解。

【技术特征摘要】
1.一种荒漠植物总DNA的提取方法，其特征在于：步骤如下：
（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到
样品粉末；
（2）在步骤（1）得到的样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取
沉淀物；所述前处理缓冲液的配方为：200mMTris-HCl+50mMEDTA+250mMNaCl+0.5-2%β巯
基乙醇；
（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；所
述提取裂解液的配方为：2%CTAB（W/V）+1.4MNaCl+0.02MEDTA+0.1MTris-HCl+0.2-0.5%
β巯基乙醇（V/V）；pH=8.0；
（4）取上清，加入酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1）混合液混匀，抽提，离心；
（5）取上清，加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀DNA30-60min；
（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；
（7）收集沉淀，加入灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵昕，张继伟，陈国雄，赵鹏善，
申请(专利权)人：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62