无细胞表达系统制备Armored RNA的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种无细胞表达系统制备Armored RNA的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术采用无细胞表达系统，首先将线性化的Armored RNA重组质粒DNA转录成mRNA，去除mRNA中的外源DNA，以mRNA为底物，使用无细胞表达系统表达Armored RNA。表达产物经PCR和RT-PCR检测，显示Armored RNA溶液中以及蛋白包膜内，都没有外源DNA的污染，PCR检测结果都为阴性；蛋白包膜包裹有外源RNA，可以使用RT-PCR方法检测到。本发明专利技术方法可有效表达Armored RNA，且表达产物无外源DNA污染，可用于制备RNA阳性参考物质以及对RNA纯度要求较高的实验。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体地，涉及一种无细胞表达系统制备ArmoredRNA的方法。
技术介绍
ArmoredRNA，国内通常翻译成假病毒，是一种保护目的RNA的蛋白颗粒。其制备原理是：使用分子生物学技术，将噬菌体MS2的成熟蛋白基因、衣壳蛋白基因和衣壳蛋白基因下游影响噬菌体包装的19bp发夹结构克隆到表达载体上，并在其下游处插入外源DNA。该载体在表达过程中能够将插入的外源DNA片段转录成RNA，同时合成的衣壳蛋白单体与成熟蛋白及RNA结合(含有19bp的发夹结构)，自发组装成180个衣壳蛋白单体包裹成熟蛋白和RNA的ArmoredRNA(图1)。ArmoredRNA颗粒与MS2噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，可以有效的保护包裹其中的RNA，且不具复制能力和传染能力。目前，ArmoredRNA越来越多地应用于RNA阳性参考物质的制备、RNA样品的保存等领域。ArmoredRNA的制备技术，分为重组质粒制备、ArmoredRNA蛋白表达和ArmoredRNA提纯3步骤。重组质粒制备基本都通过先酶切再连接的方法，将目的DNA连接入表达载体中；ArmoredRNA蛋白表达，目前普遍采用原核表达法，即将ArmoredRNA的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌中，IPTG诱导表达ArmoredRNA；提纯方法可分为离心法和亲和层析法，离心法是将表达产物经超声波破碎后，再使用差速梯度离心法或蔗糖/氯化铯梯度离心法去除杂质，从而达到提纯ArmoredRNA的目的；亲和层析法是表达载体具有6×His基因，因此表达的ArmoredRNA外膜带白带有6×His标签，可使用Ni柱进行亲和层析纯化。目前普遍采用的原核表达ArmoredRNA的方法，表达产物中含有大量外源DNA。这些外源DNA可能包裹在蛋白包膜中，因此无法用酶水解法、离心法和亲和层析法完全去除。外源DNA会对RNA实验进行干扰，影响实验结果的可靠性。例如：检测RNA病毒时，以包裹病毒RNA的ArmoredRNA为阳性对照，若提纯的RNA中混有病毒外源DNA，则不需经过反转录步骤，直接PCR扩增就能扩增出目的基因，而真正的病毒RNAPCR结果反而是阴性，这样以来ArmoredRNA失去的作为参考RNA的意义；某些RNA实验，需要RNA样品非常纯，外源DNA会干扰RNA的定量，造成实验结果出现偏差。因此迫切需要一种没有外源DNA污染的ArmoredRNA用于制备RNA阳性参考物质以及满足对RNA纯度要求较高的病原检测的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种无细胞表达系统制备ArmoredRNA的方法，以克服现有技术的不足。本专利技术提供的无细胞表达系统制备ArmoredRNA的方法，包括以下步骤：。(1)将线性化的ArmoredRNA重组质粒DNA体外转录成mRNA；(2)去除mRNA中的外源DNA；(3)以mRNA为底物，使用无细胞表达系统表达ArmoredRNA。本专利技术方法中，步骤(1)中线性化的ArmoredRNA重组质粒DNA是使用限制性内切酶将ArmoredRNA重组质粒切为线性DNA，并确保线性化酶切产物启动子—MS2基因—病毒基因的完整和连贯。所述限制性内切酶满足以下条件：(a)为ArmoredRNA重组质粒自带的酶切位点；(b)外源基因和启动子基因序列不能有该酶的酶切位点；(c)酶切位点不能在启动子与外源基因之间，以及各段外源基因之间。本专利技术方法中个，步骤(1)的体外转录成mRNA之前还包括对线性化重组质粒进行鉴定。具体地，线性化重组质粒鉴定方法为：1)将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。若电泳结果只有1条DNA条带，则凝胶回收；若电泳结果有多条DNA条带，则说明酶切位点不止1个，必须重新选择酶切位点。2)以回收的酶切产物为模板，使用检测引物进行PCR检测。若能扩增出目的基因，则说明线性化重组质粒中的外源基因完整，可继续实验；若无目的基因，则说明质粒中的外源基因已被破坏，需重新选择酶切位点进行线性化。本专利技术方法的步骤1)中将线性化的ArmoredRNA重组质粒DNA体外转录成mRNA，其100μL转录体系为：15mM的5×Buffer20μL，25mM的rNTP30μL，线性化重组质粒DNA2μg，转录酶10μL，dH2O加至总体积100μL；转录条件为37℃，3-6h。优选地，转录条件为37℃，4h。本专利技术上述方法中，步骤(2)的去除mRNA中的外源DNA的方法为：按照与转录体系的体积比1:10-1：20加入无RNA酶的DNaseI，37℃0.5h-1h。优选地，按照与转录体系的体积比1:10加入无RNA酶的DNaseI，37℃0.5h。也可以使用商品化的体外转录试剂盒进行mRNA的转录。需要注意的是体外转录试剂盒分为针对T7启动子的试剂盒和针对SP6启动子的试剂盒，需根据所使用的假病毒特征选择相应的试剂盒。在上述方法的步骤(2)和(3)之间，还包括提取转录产物中的mRNA，分别对其进行PCR和RT-PCR检测，根据上述两个检测方法的结果判断是否去除外源DNA。具体地，是使用Trizol或商业化RNA提取试剂盒提取转录产物中的mRNA。以提纯的RNA溶液为模板，使用检测引物，分别进行PCR和RT-PCR检测，检测外源DNA是否去除干净，mRNA是否能扩增出目的基因。若PCR检测结果为阴性，表明溶液中无外源DNA；若为阳性，则必须重新消化DNA。若RT-PCR检测结果为阳性，说明溶液中含有外源DNA转录生成的mRNA；若为阴性，则必须重新提取RNA，或重新转录mRNA。只有当PCR检测结果为阴性，RT-PCR检测结果为阳性时，说明溶液中只有外源DNA转录生成的mRNA，无外源DNA，此时才能进入步骤(3)，以mRNA为底物，使用无细胞表达系统表达ArmoredRNA。使用无细胞表达系统表达ArmoredRNA。表达体系：反应条件：30℃90min。反应产物4℃保存。也可以使用商品化无细胞表达试剂盒进行假病毒的表达。本专利技术提供的上述方法中，还包括步骤(4)提纯ArmoredRNA。若表达的ArmoredRNA外膜蛋白带有6×His标签，可以使用Ni-NTA亲和层析柱纯化ArmoredRNA，Ni-NTA亲和层析柱可使用商品化预装柱。若表达的ArmoredRNA外膜蛋白无6×His标签，可以使用差速梯度离心法或蔗糖/氯化铯梯度离心法提纯ArmoredRNA。本专利技术还提供了上述无细胞表达系统表达ArmoredRNA的方法在制备RNA阳性参考物质中的应用。本专利技术的无细胞表达系统表达ArmoredRNA方法获得的表达产物经PCR和RT-PCR检测，显示ArmoredRNA溶液中以及蛋白包膜内，都没有外源DNA的污染，PCR检测结果都为阴性；蛋白包膜包裹有外源RNA，可以使用RT-PCR方法检测到。本专利技术方法可有效表达Armo本文档来自技高网...

【技术保护点】
无细胞表达系统制备Armored RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将线性化的Armored RNA重组质粒DNA体外转录成mRNA；(2)去除mRNA中的外源DNA；(3)以mRNA为底物，使用无细胞表达系统表达Armored RNA。

【技术特征摘要】
1.无细胞表达系统制备ArmoredRNA的方法，其特征在于，包
括以下步骤：
(1)将线性化的ArmoredRNA重组质粒DNA体外转录成
mRNA；
(2)去除mRNA中的外源DNA；
(3)以mRNA为底物，使用无细胞表达系统表达ArmoredRNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中线性化
的ArmoredRNA重组质粒DNA是使用限制性内切酶将Armored
RNA重组质粒切为线性DNA，并确保线性化酶切产物启动子—MS2
基因—病毒基因的完整和连贯。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶
满足以下条件：
(a)为ArmoredRNA重组质粒自带的酶切位点；
(b)外源基因和启动子基因序列不能有该酶的酶切位点；
(c)酶切位点不能在启动子与外源基因之间，以及各段外源基因
之间。
4....

【专利技术属性】
技术研发人员：张旻，王娜，景宏丽，邓俊花，吴绍强，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11