一种高效的河蟹组织保存与RNA提取的方法技术

本发明专利技术公开了一种野外保存河蟹各组织及其RNA的高效提取方法，其步骤包括：（1）组织采集和保存：用无菌剪刀将组织剪成2mm左右组织块，加入适量RNAstore溶液，4℃浸泡过夜后，转入-80℃冰箱保存。（2）总RNA提取：将储存的组织从-80℃冰箱拿出，放入Trizol中，在冰上用组织研磨器将其研磨碎，离心取上清，加氯仿，再离心取上清，加异丙醇，再离心，弃上清液后加75%乙醇洗涤RNA，离心，干燥沉淀后用RNase-free水稀释。（3）RNA纯化：利用DNA酶去除RNA中的DNA。本发明专利技术方法可对野外采集的河蟹各组织进行有效保存并对其RNA进行高效提取。提取的RNA质量好、完整性强、纯度高，可用于各种分子生物学分析，尤其在转录组测序方面，有很强的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及河蟹组织野外采集组织样本的保存以及高效提取RNA的方法，属于技术应用领域。
技术介绍
河蟹，学名中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，隶属于节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacca)、十足目(Decapoda)、方蟹科(Grapsidae)，绒螯蟹属(Eriocheir)，在我国广泛分布于南北沿海各地湖泊，主要分布于长江、辽河以及瓯江流域，是我国最为重要的水产养殖对象和经济蟹类之一。近年来，随着水产养殖的发展和养殖集约化程度的不断加大，中华绒螯蟹种质的退化、爆发性疾病的发生、性早熟出现频率的加快等在带来巨大经济损失的同时，也严重制约着其产业的可持续发展。运用新一代的高通量测序技术，以转录组为平台，在全基因组范围内更深、更透彻地研究中华绒螯蟹的各项分子机制，对健康养殖、病害防治和遗传育种具有很重要的实践意义。然而，在对中华绒螯蟹进行这些研究时，经常需在野外进行采样。由于受时间、运输条件、样本重要性因素影响，不能对全部活体带回实验室进行采样，而只能采取部分组织保存后带回实验室进行RNA等分析。若保存不当，会造成后续RNA提取不成功或提取的得率很低，无法满足实验要求。因而，开发有效的组织保存方法，对于后续RNA的提取十分重要。此外，专利技术人在较长时期的河蟹RNA提取试验中，发现无论是新鲜组织还是经过一段时间保存的组织，其难度均高于其它水产动物。具体表现在RNA提取得率低、降解速度快、易受DNA污染，难以满足后续实验的需要。由此可见，开发河蟹高质量的RNA提取方法是十分重要的。另一方面，中华绒螯蟹常年栖息于淡水湖泊河流，但繁殖期间必须回到河口半咸水域，而繁殖期间在河口半咸水域采集的组织样本无法快速提取RNA，这就需要有效的河蟹RNA保存和提取方法。
技术实现思路
本专利技术人在近年来对中国各水系河蟹RNA提取的不断摸索过程中发现，通过完善组织样本的保存方式及其提取后的纯化过程，可极大的提高提取RNA纯度，使其不受DNA、蛋白质和无机试剂的污染，且可使提取的RNA完整性高，可适应于转录组测序实验等要求。本专利技术的目的在于提供一种河蟹组织保存和RNA高效提取的方法，是申请者在研究实践中发展起来的稳定技术。使用该方法可保障组织样本保存的良好性和RNA提取的高效性，提取的RNA纯度高、完整性佳、质量好，能满足转录组测序等高要求RNA。本专利技术不仅在科学技术上，且在河蟹分子生物学的研究上具有十分重要的意义和价值。本专利技术提供的技术方案是：一种高效的河蟹组织保存与RNA提取的方法，包括下列步骤：（1）组织样本保存：用无菌剪刀将短期新鲜组织样本剪成组织块，迅速浸于装在1.5ml离心管中的Trizol试剂中保存；或者将野外河蟹活体组织样本剪成组织块，按照1∶10（质量∶体积）的比例，加入RNAstore，于4℃浸泡过夜后，转入-20℃或-80℃中长期保存；（2）总RNA的提取，步骤如下：a.将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中，用组织研磨器研磨，漩涡振荡；b.离心，取上清液，加入氯仿；离心，取上清液再加入氯仿；c.离心，取上清液加入异丙醇；d.离心，弃上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精；离心，弃上清液，沉淀RNA后加入100%的酒精。e.离心后弃掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase-free水溶解。其进一步包括总RNA的纯化，步骤如下：a.向上步提取的RNA溶液中加入适量DNA酶，室温孵育。b.向所得溶液中加入β—巯基乙醇和无水乙醇，放入吸附柱中，离心，弃废液。c.向吸附柱中加入无水乙醇，离心；弃废液，空离心5min。d.向吸附柱中加入适量RNase-free水，离心即得。优选地，在第（1）步中组织材料需要剪成2mm的组织块。优选地，所述的漩涡振荡是将保存的样本于离心管中漩涡振荡45s，室温静置2分钟。优选地，在第（1）步中，将河蟹活体长期野外组织样本剪成2mm的组织块，按照1∶10（质量∶体积）的比例，加入RNAstore，于4℃浸泡过夜后，转入-20℃或-80℃中长期保存。本专利技术具有如下优点：上述方法中，所保存的河蟹各组织可用于RNA提取，且用此方法提取的RNA纯度好、质量高、完整性好。本专利技术可有效保存河蟹各组织样本，解决了野外采集组织样本RNA提取困难的问题；通过此方法提取的组织RNA质量好，可适用于RNA需求量大的多种分子生物学实验，尤其是转录组的测序，解决了保存样本RNA提取得率低、质量差的难题。该方法为河蟹多种分子机制的研究提供一项技术手段，具有重大的科学意义和实用价值。附图说明图1为本专利技术提取的河蟹各组织RNA的电泳检测结果。图2为RNAstore保存样本提取的RNA电泳图。图3为本专利技术提取的河蟹肝胰腺RNA的Agilent2100检测结果。图4为本专利技术提取的河蟹眼柄RNA的Agilent2100检测结果。图5为本专利技术提取的河蟹鳃RNA的Agilent2100检测结果。图6为本专利技术提取的河蟹肌肉RNA的Agilent2100检测结果。图7为本专利技术提取的河蟹卵巢RNA的Agilent2100检测结果。图8为本专利技术提取的河蟹精巢RNA的Agilent2100检测结果。具体实施方式本专利技术的具体实施方式如下。一、实验材料准备1.5mL离心管若干、70%乙醇溶液、碎冰、Trizol试剂、RNAstore试剂、氯仿、异丙醇、β—巯基乙醇、RNase-FreeSpinColumnsCR2(TIANGEN)、4℃离心机、活体中华绒螯蟹二、河蟹各组织的采集1.短期新鲜样本的保存：在1.5mL离心管中加入1mLTrizol试剂，将活体中华绒螯蟹的各组织采集后立即放入Trizol中，转入-80℃冰箱储存。2.野外样本的长期保存：取无菌RNase-free离心管，用无菌的剪刀、镊子将要保存的组织剪成2mm左右的组织块，然后按照1∶10（质量∶体积）的比例，加入RNAstore，于4℃浸泡过夜后，转入-20℃或-80℃可以长期保存，不影响RNA的提取。三、总RNA的提取1.在离心管中加入0.5mlTrizol溶液，将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中，用组织研磨器研磨，在加入0.5mlTrizol溶液，将离心管在漩涡振荡器上震荡45s，使溶液中各成分充分混合均匀，室温下放置2分钟。2.放入提前遇冷的4℃离心机，13500转/分钟，离心5分钟。3.小心取上清液到另一离心管中，加入300uL的氯仿，用手剧烈摇晃1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种河蟹组织样本的保存和高效提取RNA的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）组织样本保存：用无菌剪刀将短期新鲜组织样本剪成组织块，迅速浸于盛有Trizol试剂中保存；或者将河蟹活体长期野外组织样本剪成组织块，按照1∶10（质量∶体积）的比例，加入RNAstore，于4℃浸泡过夜后，转入‑20℃或‑80℃中长期保存；（2）总RNA的提取，步骤如下：a.将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中，研磨；b.漩涡振荡；c.离心，取上清液，加入氯仿；离心，取上清液再加入氯仿；d.离心，取上清液加入异丙醇；e离心，弃上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精；f.离心，弃上清液，沉淀RNA后加入100%的酒精；离心后弃掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase‑free水溶解。

【技术特征摘要】
1.一种河蟹组织样本的保存和高效提取RNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）组织样本保存：用无菌剪刀将短期新鲜组织样本剪成组织块，迅速浸于盛有Trizol
试剂中保存；或者将河蟹活体长期野外组织样本剪成组织块，按照1∶10（质量∶体积）的比
例，加入RNAstore，于4℃浸泡过夜后，转入-20℃或-80℃中长期保存；
（2）总RNA的提取，步骤如下：
a.将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中，研磨；
b.漩涡振荡；
c.离心，取上清液，加入氯仿；离心，取上清液再加入氯仿；
d.离心，取上清液加入异丙醇；
e离心，弃上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精；
f.离心，弃上清液，沉淀RNA后加入100%的酒精；
离心后弃掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase-free水溶解。
2.如权利要求1所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓雯，王军，王成辉，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31