一种草莓反转录转座子基因及转录特性制造技术

本发明专利技术公开了一种草莓反转录转座子基因序列及其转录特性分析结果。该基因DNA序列全长5386 bp，命名为FaREII，具有Ty1-copia反转录转座子基因特征序列，以gag 和 pol基因排列，其中 pol基因中包含GAG、 PR、IN、RT和RH基因的特征基序，393 bp 的长末端重复序列位于基因两端，是典型的Ty1-copia反转录转座子。通过Nothern Blot发现FaREII在激素胁迫下发生转录。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种反转录转座子基因，特别是涉及来源于草莓的反转录转座子基因及转录活性的分析。
技术介绍
草莓是多年生常绿草本植物，在植物分类学上属于蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria），是经济价值较高的小浆果，近年来国内草莓栽培生产发展很快，目前中国草莓面积和产量均居世界第一。草莓属于多年生草本植物，生产上采用无性繁殖。长期的无性繁殖导致草莓主栽品种产生和积累了较多的无性系变异。虽然科研人员能够从草莓的无性系变异植株中选育出芽变品种（如从‘全明星’中选育出了‘新明星’，从‘女峰’中选育出了‘鬼怒甘’），但是变异也导致草莓品种退化。优良种苗是草莓优质高效生产的基础，草莓微繁殖苗在田间繁殖的匍匐茎苗比普通匍匐茎苗增产、果大、品质好，所以在生产上被广泛应用。但是随着草莓微繁殖苗在生产上的大量应用，组织培养导致的体细胞无性系变异问题也越来越引起人们的关注。尽管草莓组织培养已经有30余年的历史了，但是仍存在一些悬而未决的问题。Kinet和Parmentier发现草莓品种‘戈雷拉’的微繁殖苗出现“超花”（Hyper-flower）现象，即多花、畸形、小果，这种现象可以通过匍匐茎繁殖传给子代。但至今对于“超花”现象没有合理的解释。常规的草莓微繁殖采用腋芽萌发的增殖途径，不经过愈伤组织阶段，理论上产生遗传变异的机率很低。但是随着继代次数的增加，产生变异的机率也可能增加。组织培养操作和（或）不正常的细胞分裂可能会激活反转录转座元件的转座，而SA、ABA、MeJA、H2O2、乙烯等多种与胁迫相关的信号分子能够刺激Ty1-copia反转录转座元件的转录活性。因此，随着草莓微繁殖苗继代次数的增加，反转录转座元件可能会被激活。目前，草莓离体再生植株技术（主要是叶片和花药离体再生植株技术）已比较成熟，草莓离体再生容易产生变异植株，如北京市农林科学院林业果树研究所从草莓花药培养植株后代中选育出‘宝花’、‘春选’等草莓新品种。草莓离体再生过程中产生的体细胞无性系变异是否与反转录转座子转座有关，这也有待于探索。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的草莓反转录转座子基因及转录特性分析。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：提供的草莓反转录转座子基因，来自于栽培草莓‘全明星’，名称为FaREII，是如下基因：（1）基因全长5386bp，以gag和pol基因排列，其中pol基因中包含GAG、PR、IN、RT和RH基因的特征基序，基因两端包含有393bp的长末端重复序列。（2）对本专利技术FaREII基因的进一步研究表明，该基因在激素胁迫下具有转录活性。附图说明图1：染色体步移技术获得FaREII基因全长。图2：FaREII基因结构。图3：FaREII基因聚类图。图4：pol基因的特征基序。图5：NothernBlot杂交图。具体实施方式以下实施例中所述的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1：获得FaREII基因全长。前期我们根据其它植物中反转录转座子RT基因的保守基序设计简并引物，利用PCR和RT-PCR技术，从草莓栽培品种‘全明星’中克隆到二个RT基因，通过染色体步移技术获得了一个Ty1-copia组反转录转座子FaREI，并已在NCBI上公布，Genbank登录号为FJ871121。为了系统地研究反转录转座子与草莓离体再生过程中产生的体细胞无性系变异的关系，我们对别一个反转录转座子的全序列也进行了研究。根据GenomeWalkerUniversalKit（Clontech）原理和方法进行染色体步移，将高质量草莓基因组DNA用4种限制性内切酶DraI，StuI，EcoRV，PvuII进行酶切，基于草莓反转录转座子RT基因序列，将酶切产物加上接头构建了4个用于步移的基因组文库。分别以DraI、StuI、EcoRV和PvuII4种文库为模板，以接头引物AP1和RT基因序列的外侧引物进行反转录转座元件下游染色体步移的第一步的第一轮PCR；以稀释500倍的第一轮PCR产物为模板，用接头巢式引物AP2和RT基因序列的巢式引物进行第二轮PCR扩增，结果不同文库之间扩增产物的有无，片段大小以及产物的多少差别较大，选择条带清晰，片段较大的回收、连接、转化，菌落PCR鉴定阳性克隆后，穿刺菌测序。基因全序列的获得经过了3步5′上游步移，特异片段分别为1478、2058和2612bp，1步3′下游步移，得到特异片段为2190bp。4步步移拼接后得到最长片段7199bp。在此区间包含了两个完整的LTRs序列，分别以TG起始CA结束，因此获得了一条完整的反转录转座元件的全长序列，长度为5386bp，命名为FaREII（Fragaria×ananassaretrotransposon）如图1所示。实施例2：FaREII反转录转座子序列分析。对获得的FaREII反转录转座子，通过同源搜索和多重比对进行基因结构解析和特征序列查询，发现FaREII序列具有典型的Ty1-copia类反转录转座元件的基因结构特征，序列的两端是正向重复LTR序列，紧邻5′端LTR序列的是PBS位点，在3′端LTR上游是PPT位点，PBS和PPT位点之间是GAG-POL编码区，编码的蛋白按GAG-PR-INT-RT-RNaseH顺序排列，是典型的Ty1-copia类反转录转座子基因结构（图2）。通过FaREII与其它Ty1-copia类和Ty3-gypsy类反转录转座元件的聚类分析来看（图3），FaREII也聚到了Ty1-copia类，再次说明FaREII是Ty1-copia类的反转录转座子。实施例3：pol基因的特征基序分析。植物反转录转座子的pol基因不仅是反转录转座子的基本结构域，而且现有的研究表明大多数反转录转座元件的pol基因都有自己的保守基序，保守基序的变异能反映反转录转座子的亲缘进化关系。在GAG区域含有C-C-H-C核酸结合域的保守序列，也包含PR区域的D（T/S）G特征序列；在INT区域，具有锌指结构域的H-H-C-C基序；在RT区域含有基序YVDDML；RNaseH区域的基序Ⅰ（KHI（F）D（E））和基序Ⅱ（A（S）DX2TK）。这些保守的基序在FaREII的pol基因中都存在（图4）。实施例4：FaREII反转录转座子转录活性分析。在FaREII反转录转座元件RT区域设计特异引物，采取NAA、2,4-D、ABA激素处理的方式，进行RT-PCR，用扩增片段的回收产物标记探针，进行Northern杂交，结果表明，在三种激素处理的胁迫条件下都本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草莓反转录转座子基因，其特征在于：如序列表所示，该基因命名为FaREII，DNA序列全长5386 bp，具有Ty1‑copia反转录转座子基因特征序列。

【技术特征摘要】
1.一种草莓反转录转座子基因，其特征在于：如序列表所示，该基因命名为FaREII，DNA
序列全长5386bp，具有Ty1-copia反转录转座子基因特征序列。
2.根据权利要求1所述的一种草莓反转录转座子基因，其特征在于：所述Ty1-copia反
转录转座子基因特征序列，以gag和pol基因排列。
3.根据权利要求2所述的一种草莓反转录转座子基因，其特征在于：所述的pol基因中
包含GA...

【专利技术属性】
技术研发人员：何平，李林光，李慧峰，王海波，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37