一种提取植物DNA的方法技术

一种提取植物ＤＮＡ的方法，它涉及一种提取ＤＮＡ的方法。它解决了目前植物ＤＮＡ提取方法都只对含有少量多糖的植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题。提取方法：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后转入提取缓冲液Ⅰ中进行水浴，再离心；二、取步骤一离心沉淀物转提取缓冲液Ⅱ中进行水浴，之后加入氯仿离心；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后离心，再用乙醇洗涤离心沉淀，然后干燥，即得到植物提取材料的ＤＮＡ。本发明专利技术方法是一种可以广泛使用的植物ＤＮＡ提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在ＤＮＡ提取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了ＤＮＡ提取的效率、纯度和质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提取DNA的方法。
技术介绍
DNA是分子生物学研究的主要对象之一，在进行分子生物学操作过程中, 基因组DNA的质量好坏是影响其成败的关键因素。例如，在PCR过程中多糖、 多酚和色素等都会严重的影响DNA聚合酶的活性，干扰引物与模板的结合导 致扩增失败。植物尤其是一些林木中含有大量的多糖物质，多糖是提取植物DNA的主 要干扰物质,由于它与核酸的物理性质非常相似，在提取过程中多糖物质通常 与DNA共沉淀下来，非常难与DNA分开，因此严重地影响了所提取的DNA 的质量。目前，国内外在提取植物基因组DNA过程中，为了去除多糖采用以 下几种方法①用低浓度乙醇去除多糖法在DNA提取液中加入无水乙醇至 终浓度10% 30%，再通过酚/仿抽提去除多糖，或者是先用浓度为100mmol/L 的NaAc溶解DNA沉淀，再用低浓度乙醇抽提分离出多糖；②CTAB法CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)比SDS (十二烷基硫酸钠)去除多糖类物质的效果 好，适当地提高CTAB和0 -巯基乙醇的含量(不低于1%)可有效地去除多糖等 次生物质；但是此方法中如果CTAB浓度过高，在保温时提取材料与CTAB缓 冲液难以充分混匀，这就需要延长保温时间，也同时增加了 DNA降解的机率； ③在去除多糖时采用先加不含CTAB的缓冲液抽提多糖，在通过离心除去多糖 的方法；④高盐沉淀多糖法认为缓冲液中含有高浓度的NaCl将有助于去除 多糖。但是目前的这几种去除多糖提取植物DNA的方法都只对含有少量多糖的 植物提取材料有效，而对于多糖含量高的植物(如白桦)或部位(如老叶片)基本无效，因此目前尚未有一种普遍有效的去除植物材料中多糖，保证所提取DNA质量的DNA提取方法，特别是缺乏有效的、针对多糖含量高的植 物的DNA提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决目前植物DNA提取方法都只对含有少量多糖的 植物提取材料有效，对多糖含量高的植物或部位基本无效的问题，而提供的一 种提取植物DNA的方法。提取植物DNA按以下步骤进行 一、植物提取材料用液氮研磨成粉末， 然后取0.15 0.25g研磨粉末转入lmL提取缓冲液I中在温度为45士1'C的条 件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min; 二、取步骤一离心沉淀物转 入0.5 lmL提取缓冲液II中在温度为65土rC的条件下水浴10min，之后加入 0.5 lmL氯仿在12000g的条件下离心5min;三、取步骤二离心上清液并加 入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000 12000g条件下离心10min，再用 体积浓度为75%、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀2次，然后室温气干， 即得到植物提取材料的DNA;其中步骤一中的提取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I中乙二胺四乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为0.16mol/L;步骤二中的提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基肌氨酸钠(SLS)、 巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液II中乙二胺四乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为lmol/L、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为2.5gA00mL、十二烷 基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、巯基乙醇的浓度为1 mL/100mL。本专利技术方法步骤一中在45士rC的条件下进行水浴可以使多糖和RNA完全 溶解在提取缓冲液I中，而DNA则与蛋白形成复合物DNP沉淀出来(DNP 在提取缓冲液I中溶解度极低)，因此通过离心即可将DNA与多糖及RNA分 开。本专利技术方法步骤二提取缓冲液II中CTAB的浓度提高到2.5g/100mL，同 时还加入了另一种去污剂十二垸基肌氨酸钠(SLS)，促进DNA与蛋白质的分 离，并提高了DNA在提取缓冲液II中的溶解。本专利技术方法是一种可以广泛使 用的植物DNA提取方法，它不受植物提取材料多糖含量的影响，在DNA提 取过程中可将植物中的多糖彻底去除，提高了 DNA提取的效率、纯度和质量。 附图说明图1是具体实施方式六所提取的DNA的凝胶电泳图，图2是采用现有 CTAB法所提取的DNA的凝胶电泳图。具体实施方式具体实施方式一本实施方式提取植物DNA按以下步骤进行 一、植物 提取材料用液氮研磨成粉末，然后取0.15 0.25§研磨粉末转入lmL提取缓冲 液I中在温度为45士rC的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min; 二、取步骤一离心沉淀物转入0.5 lmL提取缓冲液II中在温度为65土rC的条 件下水浴10min，之后加入0.5 lmL氯仿在12000g的条件下离心5min;三、 取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在10000 12000g 条件下离心10min，再用体积浓度为75%、体积为0.5mL的乙醇洗涤离心沉淀 2次，然后空气室温干燥，即得到植物提取材料的DNA;其中步骤一中的提 取缓冲液I由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl和去离子水组成，提取缓冲液I 中乙二胺四乙酸的浓度为50mmol/L、 NaCl的浓度为0.16mol/L;步骤二中的 提取缓冲液II由乙二胺四乙酸(EDTA)、 NaCl、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、十二垸基肌氨酸钠(SLS)、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲 液II中乙二胺四乙酸的浓度为50 mmol/L、 NaCl的浓度为lmol/L、十六烷基 三甲基溴化铵的浓度为2.5g/100mL、十二烷基肌氨酸钠的浓度为0.1g/100mL、 巯基乙醇的浓度为1 mL/100mL。本实施方式在提取过程中采用低浓度NaCl溶液去除多糖，效果显著，克 服了本领域技术人员的偏见。本实施方式方法特别适用于多糖含量高的植物材料提取DNA。本实施方式方法操作简单，易于掌握，步骤少，可有效的提高植物DNA 提取效率。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二水浴 过程中将装有提取缓冲液II和离心沉淀物的离心管颠倒3 10次。其它步骤及 参数与实施方式一相同。本实施方式可以保证反应均匀且充分，提高植物DNA的提取质量。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中加入的异丙醇的温度为0 4°C (预冷)。其它步骤及参数与实施方式一相同。 本实施方式可以有效的沉淀DNA，提高植物DNA的得率。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中加入氯仿后用振荡器震荡2 3min，然后再进行离心。其它步骤及参数与实施方 式一相同。本实施方式可以保证氯仿作用充分，有效去除杂蛋白，提高植物DNA的 质量。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点是将提取得到 的植物DNA置于TE缓冲液中保藏。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式提取白桦成熟叶片DNA按以下步骤进行一、 白桦成熟叶片用液氮研磨成粉末，然后取0.2g研磨粉末转入lmL提取缓 冲液I中在温度为45。C的条件下水浴10min，再在10000g条件下离心10min;二、 取步骤一离心沉淀物转入0.6mL提取缓冲液II中在温度为65'C的条件下 水浴10min，之后加入0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取植物ＤＮＡ的方法，其特征在于提取植物ＤＮＡ按以下步骤进行：一、植物提取材料用液氮研磨成粉末，然后取０．１５～０．２５ｇ研磨粉末转入１ｍＬ提取缓冲液Ⅰ中在温度为４５±１℃的条件下水浴１０ｍｉｎ，再在１００００ｇ条件下离心１０ｍｉｎ；二、取步骤一离心沉淀物转入０．５～１ｍＬ提取缓冲液Ⅱ中在温度为６５±１℃的条件下水浴１０ｍｉｎ，之后加入０．５～１ｍＬ氯仿在１２０００ｇ的条件下离心５ｍｉｎ；三、取步骤二离心上清液并加入上清液等体积的异丙醇，混匀后在１００００～１２０００ｇ条件下离心１０ｍｉｎ，再用体积浓度为７５％、体积为０．５ｍＬ的乙醇洗涤离心沉淀２次，然后室温气干，即得到植物提取材料的ＤＮＡ；其中步骤一中的提取缓冲液Ⅰ由乙二胺四乙酸、ＮａＣｌ和去离子水组成，提取缓冲液Ⅰ中乙二胺四乙酸的浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ的浓度为０．１６ｍｏｌ／Ｌ；步骤二中的提取缓冲液Ⅱ由乙二胺四乙酸、ＮａＣｌ、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基肌氨酸钠、巯基乙醇和去离子水组成，提取缓冲液Ⅱ中乙二胺四乙酸的浓度为５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣｌ的浓度为１ｍｏｌ／Ｌ、十六烷基三甲基溴化铵的浓度为２．５ｇ／１００ｍＬ、十二烷基肌氨酸钠的浓度为０．１ｇ／１００ｍＬ、巯基乙醇的浓度为１ｍＬ／１００ｍＬ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉成，刘桂丰，李慧玉，姜静，杨传平，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]