体液悬浮细胞DNA提取试剂盒及提取方法技术

本发明专利技术属于生物学领域，公开了一种体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，包括重悬液、蛋白酶K溶液、RNA酶A溶液、裂解液、沉淀剂、洗涤液A、洗涤液B和DNA溶解液，使用该剂盒提取体液悬浮细胞DNA的方法，包括以下步骤：离心、沉淀重悬、添加裂解液、蛋白酶K溶液裂解，添加沉淀剂离心，添加洗涤液A，与洗涤液B离心洗涤，室温干燥后添加DNA溶解液。本发明专利技术改善了当前DNA提取方法或DNA提取试剂盒中存在的价格昂贵、使用对象单一，无法适用于体液悬浮细胞DNA的提取、提取DNA完整性较差的问题，发明专利技术了一种成本低、提取DNA浓度较高、完整性好且适用于多种体液悬浮细胞DNA提取的方法及试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
体液悬浮细胞DNA提取试剂盒及提取方法
本专利技术属于生物学领域，本专利技术涉及一种提取体液(如羊水、血液、唾液、尿液)的悬浮细胞DNA提取试剂盒及提取方法。
技术介绍
机体中所含有水和分散在水里的各种物质总称为体液，体液可分为两大部分：细胞内液和细胞外液。本专利技术所述的体液指的为细胞外液；可分为血液、组织间隙液、淋巴液、脑脊液、尿液、唾液、精液等，另还有一些特殊的体液例如羊水。体液悬浮细胞指的是在体液中游离的细胞，例如羊水中游离的胎盘细胞，尿液中游离的上皮细胞，血液中游离的白细胞等等；这些细胞都反映着机体健康状态，因此可以通过检测体液悬浮细胞对疾病进行早期预警或预后判断。例如，可以通过检测羊水中游离的胎盘细胞DNA对胎儿是否患有唐氏综合症或其他遗传病疾病进行确认，通过检测尿液中的游离细胞DNA可以达到对膀胱癌早期筛查的作用。对体液悬浮细胞检测最常见方法就是对细胞提取DNA后进行检测，DNA一级结构的完整性，DNA的产量和DNA的纯度是DNA提取过程中的重要指标。然而，体液成分组成复杂，且部分体液中悬浮细胞量很少(例如羊水)，部分体液中成分复杂，因此在提取过程中纯度、产量和完整性三个指标难以同时满足。且体液悬浮细胞DNA提取试剂盒主要用于临床样本的提取，因此，如何有效的控制提取试剂盒的成本，也是体液悬浮细胞DNA在应用时需要考虑的重要因素。目前常见的DNA提取方法主要有三种：柱离心法、酚氯仿抽提法和磁珠法。柱离心法的原理是特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA(在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA)；然而柱离心法的DNA产量与最后洗脱步骤的洗脱效率有一定关系，而且在DNA洗涤过程中也会造成一定量的DNA损失，高速离心的情况下还会影响提取DNA的完整性，因此不适合细胞量少且对DNA完整性有一定需求的体液悬浮细胞DNA提取。酚氯仿抽提法是利用苯酚反复抽提，使蛋白质变性，同时DNA易溶于水而不溶于有机溶剂的原理来提取DNA，但是苯酚和氯仿都是有毒的有机溶液，对人体伤害较大，在应用上存在一定的局限性。磁珠法是采用了微纳米级磁性微珠，这种磁珠微珠的表面包裹一层硅材料来吸附核酸，进而通过磁铁吸附从而达到分离核酸的目的。但是由于该方法对磁珠性能要求较高，提取DNA的效率与磁珠的性能有密切关联，但目前市售磁珠的性能参差不齐，而高端的磁珠价格昂贵，限制了该方法的应用。中国专利技术专利CN104560959A提供了一种饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒和方法。该试剂盒包括红细胞裂解液、去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和蛋白酶K溶液；其中，所述红细胞裂解液包含8.29g/L的NH4Cl，31g/L的KHCO3和0.37g/L的Na2EDTA，pH7.2-7.4；所述去蛋白液为10％SDS，所述去蛋白沉淀液为饱和氯化钠溶液，所述调节结合液为异丙醇，所述洗脱液为70％乙醇，所述蛋白酶K溶液浓度为20mg/ml，是本申请的最接近现有技术，该方法可以实现对血液中的DNA进行提取并且进行PCR扩增，但较血液而言，部分体液成分组成复杂(如唾液)；部分体液中悬浮细胞量很少(例如羊水)，因此在提取过程中纯度、产量和完整性三个指标更难以同时满足，同时该专利技术中去蛋白液浓度高，采用10％的SDS在低温下(10℃)容易产生沉淀，需要加热溶解，使用不方便、经济成本高，最重要一点，该方法不能完成对其他体液悬浮细胞DNA提取的目的，实用性受到限制。因此开发一种成本低、无有毒有机溶液、提取DNA浓度较高、完整性好且适用于多种体液悬浮细胞DNA提取的方法及试剂盒可很好的改善当前体液悬浮细胞DNA的临床检测准确性并降低检测成本，具有重要的理论意义及实践意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。为了实现根据本专利技术的上述目的和其他优点，本专利技术提供一种体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，包括：重悬液、蛋白酶K溶液、RNA酶A溶液、裂解液、沉淀剂、洗涤液A、洗涤液B和DNA溶解液；所述重悬液选自磷酸盐缓冲液、生理盐水、Tris-HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述裂解液包括主裂解剂与辅助裂解剂；所述主裂解剂选自2-8mol/L盐酸胍、2-8mol/L硫氰酸胍、0.1-9.9％SDS或其组合；所述辅助裂解剂为Triton-100和/或吐温；所述的蛋白酶K溶液的浓度为10-19mg/mL；所述沉淀剂选自3-5mol/L的氯化钾溶液和或3-6mol/L的硫酸铵溶液；所述洗涤液A为无水乙醇或95v/v％乙醇溶液；所述洗涤液B为71-80v/v％乙醇溶液；所述的DNA溶解液选自去离子水、Tris-HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述的RNA酶A溶液的浓度为10-30mg/mL。优选的，所述裂解液还包括：DNA酶活性抑制剂和/或粘液清除剂；所述DNA酶活性抑制剂为氟苯哌苯醚溶液；所述粘液清除剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液。优选的，所述氟苯哌苯醚溶液的浓度为0.1-5mmol/L,该氟苯哌苯醚溶液中还含有0.1-0.4％的吐温帮助溶解，提高氟苯哌苯醚溶在水中的溶解性；所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液的浓度为1-10mmol/L。优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1-100mmol/L；所述添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液为1-100mmol/LTris-HCl溶液和1-10mmol/LEDTA溶液的混合液；所述Triton-100的浓度为2-8v/v％；所述吐温为吐温20或吐温60或吐温80。上述试剂盒提取体液悬浮细胞DNA的方法，也是本专利技术要求保护的的内容，包括以下操作步骤S1：取0.1-10mL体液，2000-13000rpm离心3-20分钟；S2：弃上清，加入1-5mL重悬液；将离心下来的沉淀重悬后2000-13000rpm离心3-20分钟，弃上清；S3：加入100-500μL裂解液、2-20μL蛋白酶K溶液、2-20μLRNA酶A溶液，室温裂解10-30分钟后-20℃静置2分钟；S4：加入10-200μL沉淀剂，8000-15000rpm离心1-10分钟；S5：将上清转移至新的离心管中，加入200-1000μL洗涤液A，在-20或-80℃温度下静置5-60分钟后8000-15000rpm离心1-10分钟；S6：弃上清，加入200-1000μL洗涤液B，8000-15000rpm离心1-10分钟；S7：弃上清，室温干燥1-10分钟；S8：加入20-100μLDNA溶解液即可。优选的，所述裂解液还包括：DNA酶活性抑制剂和/或粘液清除剂；所述DNA酶活性抑制剂为氟苯哌苯醚溶液；所述粘液清除剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液。优选的，所述氟苯哌苯醚溶液的浓度为0.1-5mmol/L,该氟苯哌苯醚溶液中还含有0.1-0.4％的吐温；所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液的浓度为1-10mmol/L。优选的，所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1-100mmol/L；所述添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液为1-100mmol/LTris-HCl溶液和1-10mmol/LEDTA溶液的混合液；所述Triton-本文档来自技高网...

【技术保护点】
体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，其特征在于：包括：重悬液、蛋白酶K溶液、RNA酶A溶液、裂解液、沉淀剂、洗涤液A、洗涤液B和DNA溶解液；所述重悬液选自磷酸盐缓冲液、生理盐水、Tris‑HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris‑HCl缓冲溶液中的一种；所述裂解液包括主裂解剂与辅助裂解剂；所述主裂解剂选自2‑8mol/L盐酸胍、2‑8mol/L硫氰酸胍、0.1‑9.9％SDS或其组合；所述辅助裂解剂为Triton‑100和/或吐温；所述的蛋白酶K溶液的浓度为10‑19mg/mL；所述沉淀剂选自3‑5mol/L的氯化钾溶液和或3‑6mol/L的硫酸铵溶液；所述洗涤液A为无水乙醇或95v/v％乙醇溶液；所述洗涤液B为71‑80v/v％乙醇溶液；所述的DNA溶解液选自去离子水、Tris‑HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris‑HCl缓冲溶液中的一种；所述的RNA酶A溶液的浓度为10‑30mg/mL。

【技术特征摘要】
1.体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，其特征在于：包括：重悬液、蛋白酶K溶液、RNA酶A溶液、裂解液、沉淀剂、洗涤液A、洗涤液B和DNA溶解液；所述重悬液选自磷酸盐缓冲液、生理盐水、Tris-HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述裂解液包括主裂解剂与辅助裂解剂；所述主裂解剂选自2-8mol/L盐酸胍、2-8mol/L硫氰酸胍、0.1-9.9％SDS或其组合；所述辅助裂解剂为Triton-100和/或吐温；所述的蛋白酶K溶液的浓度为10-19mg/mL；所述沉淀剂选自3-5mol/L的氯化钾溶液和或3-6mol/L的硫酸铵溶液；所述洗涤液A为无水乙醇或95v/v％乙醇溶液；所述洗涤液B为71-80v/v％乙醇溶液；所述的DNA溶解液选自去离子水、Tris-HCl缓冲溶液、添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液中的一种；所述的RNA酶A溶液的浓度为10-30mg/mL。2.根据权利要求1所述的体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液还包括：DNA酶活性抑制剂和/或粘液清除剂；所述DNA酶活性抑制剂为氟苯哌苯醚溶液；所述粘液清除剂为N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液。3.根据权利要求2所述的体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，其特征在于：所述氟苯哌苯醚溶液的浓度为0.1-5mmol/L；所述N-乙酰基-L-半胱氨酸溶液的浓度为1-10mmol/L。4.根据权利要求1所述的体液悬浮细胞DNA提取试剂盒，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1-100mmol/L；所述添加EDTA的Tris-HCl缓冲溶液为1-100mmol/LTris-HCl溶液和1-10mmol/LEDTA溶液的混合液；所述Triton-100的浓度为2-8v/v％；所述吐温为吐温20或吐温60或吐温80。5.用权利要求1所述试剂盒提取体液悬浮细胞DNA的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵国栋，关淼，高珅，马勇，郑岷雪，
申请(专利权)人：苏州国科闻普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32