用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂、核酸片段复制方法、应用技术

本发明专利技术提供一种用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：特异性序列，用以自单链核酸分子模板5’端所在侧与二级结构的第一茎臂序列互补配对；末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸；其中，所述第一茎臂序列为二级结构靠近所述模板5’端一侧茎臂全部或至少一端序列段。本发明专利技术还提供一种核酸片段复制方法及应用。本发明专利技术的试剂在单链核酸复制过程中通过其特异性序列与模板内互补配对的二级结构相竞争，形成特异性序列与模板二级结构部分区域的杂交产物同时解链模板中二级结构，进而在引物延伸过程中消除模板中二级结构对核酸聚合酶的阻碍作用。

【技术实现步骤摘要】
用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂、核酸片段复制方法、应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种用于提高具有分子内二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂、核酸片段复制方法、应用。
技术介绍
单链核酸在内部存在互补序列时，按照碱基互补配对原则可以形成分子内二级结构。首先，核酸的分子内二级结构在生物体内具有重要的生物学作用。例如，转运RNA形成的三叶草状的分子内二级结构对于其在翻译过程中发挥氨基酸转运作用至关重要，而核糖体RNA形成的高度复杂的分子内二级结构则是保障核糖体结构并实现其以信使RNA为模板合成肽链的功能所必须的。此外，非正常的核酸分子内二级结构还与人类的一些疾病有关。例如，在基因组DNA的复制过程中，(CNG)n简单重复形成的分子内二级结构所造成的CNG重复数的增加被认为和某些神经系统疾病相关。其次，除了生物学意义以外，核酸的分子内二级结构在科学研究和生物
也有很多实际应用。分子信标(molecularbeacon)是一类可以形成茎环结构(核酸分子内二级结构的一种类型)的单链DNA或RNA，通常被用来作为某些核酸检测方法中的探针。适配体(aptamer)是一类人为设计的单链DNA或者RNA，能够形成特殊的分子内二级结构以实现对蛋白质等不同类型分子的特异性识别。最后，核酸分子内二级结构对常用的分子生物学方法的一些实际应用也有一定的影响。例如，可以形成稳定的分子内二级结构的单链DNA模板对PCR反应具有一定的抑制作用。自1988年专利技术以来，聚合酶链式反应(PCR)已经成为生命科学、基础医学、体外诊断、食品安全、公共卫生监测和工业生物技术等多个领域中应用最广泛的分子生物学方法之一。由于具有指数放大效应，PCR可以达到检测低丰度序列所需的高灵敏度，因此已成为大多数核酸检测技术所采用的方法。随着荧光染料或荧光探针的引入，普通PCR升级为定量PCR而进一步提高了其灵敏度和特异性。在PCR反应中，双链DNA模板首先在高温下解链成两条单链，然后反应体系温度快速降低，促使引物与模板的结合以启动聚合酶对引物的延伸直至形成完整的双链DNA产物。其中在降温过程中，由于动力学的原因，自身含有互补序列的单链DNA模板会首先形成分子内二级结构。稳定的模板分子内二级结构对PCR反应主要有两个方面的影响，首先是加大扩增反应的错误率；其次是降低PCR的技术性能。低丰度DNA的检测对检测方法的灵敏度要求很高，如体外诊断中对癌症患者外周血中的循环肿瘤DNA或者低载量的病原体的检测等。由于模板中稳定的分子内二级结构造成的PCR灵敏度的降低将会大大削弱其临床应用价值。测序技术是另一种常用的分子生物学方法，在生命科学、基础医学和体外诊断等领域均有广泛的应用。特别是在新兴的基因治疗和核酸疫苗等领域中，由于这类产品直接应用于人体，出于安全性的考虑，必须保证每一个批次产品的核酸序列都完全相同。这一验证过程只能通过测序来完成。另外，以RNA为模板合成DNA的逆转录反应不仅在生物界广泛存在，而且在生命科学、基础医学和体外诊断等领域同样应用广泛。逆转录反应是以RNA为检测对象的体外诊断技术的一个必不可少的步骤，其反应性能对最终的检测灵敏度和特异性有着重要影响。例如，作为RNA病毒，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的核酸检测离不开逆转录反应。测序技术和逆转录反应的基本原理与PCR反应相同，都是以已有核酸分子为模板、通过碱基互补配对原则由核酸聚合酶合成新的核酸分子。因此，模板中稳定的分子内二级结构同样会对这两种分目前，对于技术性能较差的PCR反应，除了常规的优化反应条件的策略(调整PCR反应配方中不同组份的浓度以及PCR反应程序中不同步骤的温度或时长等)以外，向反应体系中加入某些添加剂也可以达到提高PCR反应性能的作用，如二甲基亚砜(DMSO)、甜菜碱(betaine)或甲酰胺(formamide)等。大部分技术性能较差的PCR反应往往是由于DNA模板中富含GC造成的，其原因在于G-C碱基对的热稳定性显著高于A-T碱基对，因而在单链状态下更易于形成稳定的分子内二级结构。而DMSO和betaine被认为可以降低分子内二级结构的稳定性，进而提高PCR反应性能。但此类添加剂仍有它们的局限性，比如，添加剂浓度过高会抑制DNA聚合酶本身的活性、降低PCR反应的特异性以及加大产物错误率等。此外，如果模板的分子内二级结构非常稳定，在不产生严重副作用的前提下，此类添加剂提升PCR反应性能的作用非常有限，甚至完全无效。基于同一原理，包含稳定的单链分子内二级结构的富含GC的DNA模板的测序反应的成功率也往往大大低于不含此类二级结构的模板。尽管向此类测序反应中加入上述添加剂可以部分地提升反应成功率，但与它们在PCR反应中所起的作用一样，这些添加剂提高测序反应成功率的作用具有同样的局限性。综上所述，对于以核酸分子为模板、通过碱基互补配对原则由核酸聚合酶合成新的核酸分子的分子生物学方法，如PCR、测序、转录反应和逆转录反应等，模板单链中潜在的稳定的分子内二级结构往往对相应方法的技术性能产生不利影响，而且至今尚没有适用广泛、机理清晰且没有副作用的消除此类不利影响的方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，破坏模板单链中潜在的稳定的分子内二级结构的稳定性，消除模板单链中潜在的稳定的分子内二级结构对相应分子生物学技术产生的不利影响。为了实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案实现。本专利技术提供一种用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：特异性序列，用以自单链核酸分子模板5’端所在侧与二级结构的第一茎臂序列互补配对；末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸；其中，所述第一茎臂序列为二级结构靠近所述模板5’端一侧茎臂全部或至少一端序列段。优选地，所述特异性序列包括用以与所述第一茎臂序列互补配对的碱基序列、至少一段用以与所述第一茎臂序列末端延续的非互补配对序列进行互补配对的碱基序列。优选地，所述末端修饰结构包括小沟结合物、倒置DNA核苷酸、C3间隔区、及不与所述模板杂交的寡聚核苷酸链。优选地，所述试剂的合成单体包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸；若干单体间连接方式包括磷酸二酯键连接或肽键连接。优选地，用以与所述第一茎臂序列互补配对的碱基序列总长度为4～46nt；用以与所述第一茎臂序列末端延续的非互补配对序列进行互补配对的碱基序列总长度为4～46nt。本专利技术第二个目的是提供一种核酸片段复制方法，在具有二级结构的单链核酸模板的体外复制反应体系中添加如上所述的用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，通过所述试剂破坏所述模板中二级结构内的碱基配对，以消减分子内二级结构对核酸聚合酶的阻碍作用。优选地，具体包括步骤：在核酸片段复制反应开始前，向反应体系中加入所述试剂；所述试剂的反应起始浓度为0.01μM～5μM。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，其特征在于，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：/n特异性序列，用以自单链核酸分子模板5’端所在侧与二级结构的第一茎臂序列互补配对；/n末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸；/n其中，所述第一茎臂序列为二级结构靠近所述模板5’端一侧茎臂全部或至少一端序列段。/n

【技术特征摘要】
1.用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，其特征在于，所述试剂为寡聚核苷酸链，依次包括：
特异性序列，用以自单链核酸分子模板5’端所在侧与二级结构的第一茎臂序列互补配对；
末端修饰结构，用以阻止所述特异性序列的3’端通过核酸聚合酶而延伸；
其中，所述第一茎臂序列为二级结构靠近所述模板5’端一侧茎臂全部或至少一端序列段。


2.根据权利要求1所述的用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，其特征在于，所述特异性序列包括用以与所述第一茎臂序列互补配对的碱基序列、至少一段用以与所述第一茎臂序列末端延续的非互补配对序列进行互补配对的碱基序列。


3.根据权利要求1所述的用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，其特征在于，所述末端修饰结构包括小沟结合物、倒置DNA核苷酸、C3间隔区、及不与所述模板杂交的寡聚核苷酸链。


4.根据权利要求1所述的用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，其特征在于，所述试剂的合成单体包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸；若干单体间连接方式包括磷酸二酯键连接或肽键连接。


5.根据权利要求2所述的用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂，其特征在于，用以与所述第一茎臂序列互补配对的碱基序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兆成，马勇，郑岷雪，赵国栋，熊尚岷，
申请(专利权)人：苏州国科闻普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32