引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及生物领域，特别涉及引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒。本发明专利技术根据获得的五种异尖线虫的ITS区通过DNAMAN进行序列比对设计通用引物。本发明专利技术建立的RPA方法可扩增出异尖线虫基因组的目的片段在340bp左右，可特异性的检测出异尖线虫，而对阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫检测结果成阴性。优化后在35℃、25min即可完成检测，其灵敏度可达1pg/μL，人工模拟污染样品结果呈阳性。此方法操作简单、便捷，对现场快速检测具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒
本专利技术涉及生物领域，特别涉及引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒。
技术介绍
食源性寄生虫病是指进食生鲜的或未经彻底加热煮熟的含有寄生虫虫卵或幼虫的食品而感染的一类疾病的总称。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食来源和方式的多样化使食源性寄生虫病的暴发时有发生，由食品寄生虫引发的食品安全问题愈加突出。食源性寄生虫病不仅是影响我国人民健康的主要因素之一，且已成为重要的全球疾病负担之一。异尖线虫是一种重要的食源性人兽共患的寄生虫，其分布范围广泛，很多鱼类和头足类动物都可以感染异尖线虫。异尖线虫的幼虫主要寄生于海鱼，成虫寄生于海洋哺乳动物体内。当人生食或半生食含有异尖线虫Ⅲ期幼虫的鱼可以引起异尖线虫病(anisakiasis)，其除了引起人强烈的胃肠反应外，还可以导致人的过敏症状，引起局部的皮肤肿胀，甚至过敏性休克从而危及生命。异尖线虫可以入侵肠壁直接导致组织损伤，伴随着嗜酸性肉芽肿的特征；由于人类不是异尖线虫的最佳宿主，所以异尖线虫感染人后容易发生异位的现象，如肠穿孔。目前人们对于异尖线虫的认识还不够全面。所以在临床中，异尖线虫病患者经常被误诊为其他疾病，胃部的异尖线虫病经常误诊为胃溃疡、胃息肉，肠道的异尖线虫病经常误诊为盲肠炎或腹膜炎。当下异尖线虫病还没有有效的治疗措施，临床上通常通过内窥镜人工的方法将虫体从人体中取出。近年来随着人们饮食结构的改变，饮食文化不断多元化，对于腌制品、寿司、生鱼片等一系列的食用越来越多，导致现在异尖线虫病的发病率也逐渐升高。联合国粮农组织(FAO)将异尖线虫列为重要的致病因子，我国也将其列为国家禁止入境的二类动物寄生虫。因此,建立海产品尤其是鱼类产品中异尖线虫的检测体系,对于主动预防、控制其安全危害人们健康是非常必要和重要的意义。目前水产加工企业对海产品异尖线虫筛检常常为灯检法:包括日光灯检法和紫外灯检法，前者利用白色透射光和反射光的共同作用，使得鱼肉内虫体呈不同颜色或阴影；后者利用紫外线激发虫体产生明亮的点状或条线状的荧光加以辨别。其虽简便快速但准确性欠佳，检出率仅为60％～70％，容易误检、漏检。同时异尖线虫的检测标准《SC/T7210-2011鱼类简单异尖线虫幼虫检测方法》依靠形态学方法和以PCR技术为基础的分子生物学方法。其中形态学鉴定因异尖线虫虫种种属多，其形态结构存在很大的差异而使鉴定不准确，而且需要受过专业训练的专业人员与专用仪器设备才能完成；使用PCR技术对虫体的基因进行扩增，通过测序比对可以判定虫种，但其周期漫长，需要笨重的仪器才能完成，耗时耗力，很难在基层推广。因此阻碍了在实际的应用。近年来核酸等温扩增技术逐步发展成熟，其不依赖复杂的仪器，也不需要热稳定的聚合酶，可以大大降低仪器成本、复杂性并实现便携性，值得在资源相对匮乏地区推广应用。LAMP(Loop-mediatedisothermalamplification)因其高特异性和灵敏度成为当前研究和应用相对广泛的等温扩增技术之一。但LAMP法的引物设计较复杂，数量多、难度大，需根据6个特定区域设计4对引物，且其扩增产物是一些大小不等的片段，易形成气溶胶而造成实验室的环境污染。因此，LAMP反应极易受到污染而产生假阳性结果，对操作人员及检测环境都有较高要求。综上，建立快速准确便捷的异尖线虫测方法对的食品安全和进出口水产品的检疫工作都有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了引物组合、异尖线虫的检测试剂或试剂盒。该引物组合的灵敏度可达1pg/μL，人工模拟污染样品结果呈阳性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了引物组合，所述引物具有：(I)、上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和(II)、下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(III)、如(I)和/或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；(IV)、与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。本专利技术还提供了所述的引物组合在制备扩增异尖线虫基因组的试剂或试剂盒中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增的温度为30～40℃，所述扩增的时间为10～25min。在本专利技术的一些具体实施方案中，以体积份计，所述扩增的反应体系为：本专利技术还提供了所述的引物组合在制备异尖线虫的检测试剂或试剂盒中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增的温度为30～40℃，所述扩增的时间为10～25min。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述扩增的温度为35℃，所述扩增的时间为25min。在本专利技术的一些具体实施方案中，总体积为50μL，所述扩增的反应体系为：基于上述研究，本专利技术还提供了异尖线虫的检测试剂，包括所述的引物组合以及可接受的助剂。本专利技术还提供了异尖线虫的检测试剂盒，包括所述的引物组合以及可接受的助剂或载体。此外，本专利技术还提供了异尖线虫的检测方法，取待测样本经所述的引物组合扩增、检测。重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，RPA)是一种新型的等温核酸体外扩增技术，其引物设计简单，反应在37-42℃下进行5～20min即可得到与传统PCR反应相当，可用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。RPA反应简单快速，不需要高温循环，对仪器的需求大大降低，在现场检测显示出突出的优越性。同时RPA检测技术灵活性强，可以与多种检测方法结合，其基础反应体系与其他技术结合，延伸出多功能多用途的核酸检测技术，可以真正实现便携式的快速核酸检测，发展空间大。本专利技术对东海沿海舟山、温州、宁波、平潭、嘉兴市的九种鱼体内获得的异尖线虫用吸虫和线虫ITS区通用引物NC5-F、NC2-R进行PCR扩增。然后对PCR产物测序比对进行鉴定，获得了派氏异尖线虫、简单异尖线虫、典型异尖线虫、宫脂线虫和对盲囊线虫。然后根据获得的五种异尖线虫的ITS区通过DNAMAN进行序列比对设计通用引物。本专利技术建立的RPA方法可扩增出异尖线虫基因组的目的片段在340bp左右，可特异性的检测出异尖线虫，而对阔节裂头绦虫、华支睾吸虫、东方次睾吸虫、棘颚口线虫检测结果成阴性。优化后在35℃、25min即可完成检测，其灵敏度可达1pg/μL，人工模拟污染样品结果呈阳性。此方法操作简单、便捷，对现场快速检测具有重要的意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示引物的筛选结果；其中，M:DNA分子量标准(DL1500)；1：ITS-1；2：ITS-2；3：ITS-3；4：ITS-4；5：ITS-5；6：ITS-6；7：ITS-7；8：ITS-8；图2示不同反应时间扩增结果；其中，M：DNA分子量标准(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组合，其特征在于，所述引物具有：/n(I)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和/n(II)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或/n(III)、如(I)和/或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；/n(IV)、与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.引物组合，其特征在于，所述引物具有：
(I)、上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和
(II)、下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或
(III)、如(I)和/或(II)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；
(IV)、与(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。


2.如权利要求1所述的引物组合在制备扩增异尖线虫基因组的试剂或试剂盒中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述扩增的温度为30～40℃，所述扩增的时间为10～25min。


4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，以体积份计，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明远，刘晓雷，白雪，杨勇，唐斌，李辰，张春玲，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22