【技术实现步骤摘要】
一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法
本专利技术涉及基因工程领域,具体涉及一种生物素化的dsODN及其构建GUIDE-pro库的方法。
技术介绍
在基因治疗、药物发现、靶向基因调控、表观遗传调控、染色质操纵和活细胞染色质成像等广泛领域,CRISPR已被证明是一种高度通用的基因编辑工具,具有巨大的潜力。然而,CRISPR技术的准确性和可靠性受到识别和切割近认知DNA序列到目标位点所造成的脱靶效应的严重阻碍。因此,在给定目标位点的各种候选物中鉴定最佳的gRNA,以及潜在的脱靶位点的定位对于保持安全有效的CRISPR扩增是非常重要的。但是,如何快速筛选最佳的gRNA并敏感地检测所有潜在的脱靶仍然是一个巨大的挑战。GUIDE-seq是一种在全基因组水平无偏倚性检测CRISPR脱靶效应的方法。它依赖于非同源末端连接(NHEJ)介导的外源供应的双链寡脱氧核苷酸(dsODNs)与CRISPR/Cas产生的DNA双链断裂(DSBs)的整合。因此,GUIDE-seq的敏感性和特异性受dsODN整合效率的影响。而dsODN的整合效率进一步受到DSB类型(钝性末端或粘性末端)、DSB序列上下游序列以及DNA修复过程中DSB附近的dsODN浓度浓度的影响。并且,由真核细胞有丝分裂过程会产生DNA损伤进而产生背景DSB,这些非DSB切割产生的背景DSB同样有机会整合dsODN。而这些背景DSB整合了dsODN的位点将被GUIDE-seq检测到,但是是非CRISPR切割产生的假阳性脱靶位点。另一方面,有一些脱靶位点 ...
【技术保护点】
1.一种生物素化的dsODN,其特征在于所述的生物素化的dsODN序列如下:/n5’-G*T*TTAATTGAG/iBiodT/TGTCATA/iBiodT/GTTAA/iBiodT/AACGGT*A*T-3’;/n5’-A*T*ACCGTTA/iBiodT/TAACATA/iBiodT/GACAAC/iBiodT/CAATTAA*A*C-3’。/n
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
1.一种生物素化的dsODN,其特征在于所述的生物素化的dsODN序列如下:
5’-G*T*TTAATTGAG/iBiodT/TGTCATA/iBiodT/GTTAA/iBiodT/AACGGT*A*T-3’;
5’-A*T*ACCGTTA/iBiodT/TAACATA/iBiodT/GACAAC/iBiodT/CAATTAA*A*C-3’。
2.根据权利要求1所述的一种生物素化的dsODN,其特征在于采用生物素化的dsODN,利用GUIDE-pro建库用引物序列如下:
P701
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P702
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P703
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P704
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P705
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P706
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P707
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P708
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTGACTGGAGTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGA;
P5_1AATGATACGGCGACCACCGAGATCTA;
P5_2AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC;
A01
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A02
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTCTCTATNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A03
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATCCTCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A04
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGAGTAGANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A05
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTAAGGAGNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A06
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACTGCATANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A07
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAAGGAGTANNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A08
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCTAAGCCTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
A09
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGACATTGTNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T;
技术研发人员:谢红娴,兰凯,程欢欢,黄龙,
申请(专利权)人:珠海舒桐医疗科技有限公司,
类型:发明
国别省市:广东;44
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