本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种Cas9蛋白、II型CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用。本发明专利技术筛选了一种Cas9蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3中任一种序列所示。本发明专利技术还提供了一种编码Cas9蛋白的核苷酸序列。本发明专利技术提供了一种II型CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括上述的Cas9蛋白、辅助蛋白、CRISPR RNA和tracrRNA序列。采用本发明专利技术的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统能够在crRNA的引导下，在原核细胞或真核细胞中行使基因编辑功能。本发明专利技术Cas9蛋白及基因编辑系统的发现扩大了基因编辑工具的种类，对推动基因编辑应用于临床治疗具有重要的作用。重要的作用。重要的作用。
【技术实现步骤摘要】
succinatiphilus细菌中的DsuCas9。采用本专利技术Cas9蛋白的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统可识别多种不同的PAM序列，HqCas9识别的PAM序列为NGNGNC，相对比较复杂的PAM可以更精确的识别靶位点，提高Cas9蛋白识别的精确性。DspCas9与DsuCas9所识别的PAM相近，第4位和第5位均为A，两个蛋白都可识别PAM为NNNAA的靶位点。通过对人类基因组上“AA”序列位点覆盖的长度频率进行分析，平均每隔5bp就有一个AA出现，这极大的增加了DspCas9与DsuCas9在人类基因组上的靶向范围，克服了SpCas9的局限性。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种编码Cas9蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10～12中任一种序列所示。
[0010]第三方面，本专利技术提供了一种II型CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括上述的Cas9蛋白、辅助蛋白、CRISPR RNA和tracrRNA序列。
[0011]采用本专利技术的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统能够在crRNA的引导下，在原核细胞或真核细胞中行使基因编辑功能。本专利技术的基因编辑系统的发现扩大了基因编辑工具的种类，对推动基因编辑应用于临床治疗具有重要的作用。
[0012]作为本专利技术所述的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述tracrRNA序列包括重复序列，所述重复序列如SEQ ID NO.7～9中任一种序列所示。进一步的，所述的tracrRNA序列如SEQ ID NO.14～16中任一种序列所示。
[0013]作为本专利技术所述的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统的优选实施方式，所述辅助蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4～6中任一种序列所示。
[0014]第四方面，本专利技术将所述II型CRISPR/Cas9基因编辑系统在原核或真核生物基因编辑中的应用。
[0015]第五方面，本专利技术将所述II型CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备生物基因编辑制剂中的应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0017](1)本专利技术的三种II型CRISPR/Cas9基因编辑系统可以识别特定的PAM序列(NGNGNC、NNNAA、NNNAA)，能够在crRNA的引导下在原核环境或真核细胞中行使基因编辑功能，极大的增加了可靶向的范围，克服了SpCas9的局限性。
[0018](2)采用本专利技术Cas9蛋白的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统能够在crRNA的引导下，在原核细胞或真核细胞中行使基因编辑功能。本专利技术Cas9蛋白及基因编辑系统的发现扩大了基因编辑工具的种类，对推动基因编辑应用于临床治疗具有重要的作用。
附图说明
[0019]图1为本专利技术CRISPR/Cas9基因编辑系统的进化树、系统组成和蛋白生物信息学分析结果示意图。
[0020]图2为本专利技术三种CRISPR/Cas9基因编辑系统的原核PAM序列图。
[0021]图3为本专利技术三种CRISPR/Cas9基因编辑系统的原核干扰图。
[0022]图4为本专利技术三种CRISPR/Cas9基因编辑系统的NC确认原核干扰图。
[0023]图5为本专利技术三种CRISPR/Cas9基因编辑系统的scaffold结构图。
[0024]图6为本专利技术三种CRISPR/Cas9基因编辑系统的真核细胞spacer最适长度探究图。
[0025]图7为本专利技术所述三种CRISPR/Cas9基因编辑系统的GUIDE
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seq在靶与脱靶检测
图。
具体实施方式
[0026]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术所述Cas9核酸内切酶是一种DNA内切酶。本专利技术所述的碱基序列中的所述N，表示A、G、C、T中的任意一种。本专利技术所述的Cas9蛋白，是一种多结构域的DNA核酸内切酶，包括REC结构域、RuvC结构域、HNH结构域和PI结构域，它能识别在PAM5
’
端识别与sgRNA互补的DNA序列，分别通过HNH结构域切割与sgRNA互补的DNA链，RuvC结构域切割非互补链DNA。本专利技术所述的crRNA，以碱基互补的方式引导Cas蛋白识别入侵的DNA，5
’
端为间隔序列，与靶DNA互补，3
’
端为重复序列。本专利技术所述CRISPR/Cas9基因编辑系统还需要tracrRNA的参与，tracrRNA是单独转录的，tracrRNA与pre
‑
crRNA通过剪辑互补配对结合，经过RNA酶III酶切处理将pre
‑
crRNA的5
’
部分间隔序列和3
’
部分重复序列，形成成熟的crRNA，与tracrRNA结合形成tracrRNA
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crRNA复合体，通过在crRNA下游和tracrRNA上游之间添加四个碱基的tetraloop(如“GAAA”、“TGAA”或“AAAC”序列)可以将tracrRNA和crRNA连接起来形成scaffold。通过调节tracrRNA的长度以及可识别间隔序列的长度能进一步优化Cas9核酸内切酶的切割功能。
[0027]实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]实施例1：三种新型CRISPR/Cas9基因编辑系统
[0029]利用宏基因组生物信息手段对II型CRISPR/Cas9基因编辑系统相关蛋白及其元件进行分析、预测、筛选，利用CRISPRCas Finder软件进行宏基因组注释，通过NUPACK软件预测crRNA和tracrRNA的二级结构，使用HHpred软件预测功能域，并利用FastTree软件构建系统发育树。提供了三种新II型CRISPR/Cas9基因编辑系统，包括Cas9蛋白、辅助蛋白、CRISPR RNA和tracrRNA，如图1所示。
[0030]本专利技术筛选得到三种新型编辑系统的Cas9蛋白，分别来自：一种未注释细菌继而将其命名为HqCas9；Dialister sp.900538805细菌中的DspCas9；Dialister succinatiphilus细菌中的DsuCas9。HqCas9蛋白编码1353个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.1所示；DspCas9蛋白编码1383个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.2所示；DsuCas9蛋白编码1389个氨基酸，其序列如SEQ ID NO.3所示。将3种Cas9蛋白与已发表的其他14种II型CRISPR/Cas9基因编辑系统进行系统发育树分析，显示HqCas9、DspCas9、DsuCas9归为Type II A这一支，三种Cas9蛋白之间序列相似性较高，与FrCas9亲缘关本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种Cas9蛋白，其特征在于，所述Cas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3中任一种序列所示。2.一种编码权利要求1所述Cas9蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10～12中任一种序列所示。3.一种II型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，包括如权利要求1所述的Cas9蛋白、辅助蛋白、CRISPR RNA和tracrRNA序列。4.根据权利要求3所述的II型CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述tracrRNA序列包括重复序列，所述重复序列如SEQ ID NO.7～...
【专利技术属性】
技术研发人员：田瑞，赵停停，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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