本发明专利技术公开了一种DSB
【技术实现步骤摘要】
DSB
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PE基因编辑系统及其应用
[0001]本专利技术涉及基因编辑
,尤其涉及DSB
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PE基因编辑系统及其应用。
技术介绍
[0002]基因编辑技术作为生命科学的新兴研究领域,可直接对遗传物质中的特定序列进行定点敲除、插入或突变,为基因的功能研究、基因检测和治疗提供了强有力的工具,极大地推动了生命科学的发展。随着对基因编辑技术的不断探索,新型核酸酶的发现使基因编辑技术发生了质的飞跃,锌指核酸酶技术(zinc finger nucleases,ZFNs)、类转录激活因子效应核酸酶技术(transcription activator
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like effectors nucleases,TALENs)、规律成簇间隔的短回文重复相关蛋白技术(clustered regμlarly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR
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associated protein 9,CRISPR/Cas9)等基因编辑技术相继出现。其中,CRISPR/Cas9基因编辑技术以其效率高、特异性强及可扩展性等优势在基因编辑领域占据了越来越重要的地位。
[0003]然而,随着越来越多的基因变异类型被证实,单纯的CRISPR/Cas9基因编辑技术无法对产生的碱基缺失、替换及插入等进行编辑纠正,已经难以满足基因治疗的要求。为了解决这一难题,引导编辑Prime Editor(PE)基因编辑技术应运而生,这种方法可以在不引入双链断裂(DSB)和供体DNA模板的前提下,实现靶标位点的插入、缺失和所有12种类型点突变(目前ABE和CBE系统仅能实现C
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T,G
→
A,A
→
G,T
→
C四种突变类型),扩展了碱基编辑的范围,提高了精准编辑的效率。PE是一种基于搜索和替换(search
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and
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replace)的基因组编辑方式,引导编辑的搜索功能是基于改造的向导RNA(the engineered guide RNA,the pegRNA),pegRNA中包含我们熟知的single guide RNAs(sgRNAs),不同的是,在其3
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端还有一段引物结合序列(Primer binding site,PBS)和转录模板序列(RT template,RTT)。prime editor蛋白由nCas9切口酶(Cas9nickase,仅有切割单链的功能,H840A)和逆转录酶(M
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MLV RT)融合而成。这样,nCas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下,切割DNA单链,pegRNA3
’
端的PBS(引物结合序列)可以与切割断点前的互补序列识别配对,逆转录酶(M
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MLV RT)以pegRNA上PBS序列后的人工设计的模板序列为模板进行逆转录,将目标序列直接聚合到切口的DNA链上,可以在无需引入双链断裂和外源DNA模板的情况下,有效地产生精确的碱基转换或颠换、插入和缺失等变异。
[0004]然而,不同的PE编辑系统对同一位点进行编辑时,编辑效率不尽相同,pegRNA中PBS序列长度、RTT序列长度以及切口sgRNA的位置都会影响其基因编辑效率;进行插入或缺失编辑时,插入或缺失片段的增长也会导致其编辑效率降低。此外,目前PE编辑系统利用仅具有单链DNA切割功能的nCas9切口酶,降低了编辑副产物indel的发生率,但其切割活性较野生型Cas9大大降低。另外,nCas9切割DNA单链后,主要依靠细胞内同源重组修复途径(homology directed repair,HDR)进行修复,大量研究证实该途径修复效率较低,且主要在细胞增殖的DNA复制S期和G2期发挥作用,无法实现在神经细胞、肌细胞等永久性细胞、及非增殖期体细胞中高效的基因编辑。因此,提高PE编辑系统的编辑效率、拓展其编辑应用范
围十分必要。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供DSB
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PE基因编辑系统及其应用。该编辑系统相比PE基因编辑系统,编辑效率高、应用范围更广泛,并且在不影响切割效率的情况下大大提升目标碱基准确插入比率,提高DSB
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PE系统的生物安全性。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现:DSB
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PE基因编辑系统,包括融合蛋白和pegRNA;所述pegRNA依次由spacer、scaffold尾端碱基、靶点序列以及PBS组成,靶点序列与scaffold尾端碱基及其互补配对碱基之间不包括逆转录模板;所述融合蛋白为野生型Cas9切刻酶与逆转录酶RT融合所形成。
[0007]所述scaffold尾端碱基为A1、A2或A3:
[0008]A1.将如SEQ ID NO.1所示的pegRNA序列第82
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96位替换为ABaccgagtcggtCD得到的RNA分子,其中,CD序列为目标插入序列末尾两个碱基的反向互补序列,A序列为D序列的互补配对序列,B序列为C序列的互补配对序列;
[0009]A2.将所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子;
[0010]A3.与A1或A2限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性且具有相同功能的RNA分子。
[0011]所述野生型Cas9切刻酶为B1或B2:
[0012]B1.氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的蛋白质;
[0013]B2.将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
[0014]所述野生型Cas9切刻酶的编码基因为C1、C2或C3:
[0015]C1.SEQ ID NO.3所示序列第715位
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第4815位的cDNA分子或DNA分子;
[0016]C2.与C1限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码所述野生型Cas9切刻酶的cDNA分子或DNA分子;
[0017]C3.在严格条件下与C1或C2限定的核苷酸序列杂交,且编码所述野生型Cas9切刻酶的cDNA分子或DNA分子。
[0018]所述逆转录酶RT为D1或D2:
[0019]D1.氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的蛋白质;
[0020]D2.将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
[0021]所述逆转录酶RT的编码基因为E1、E2或E3:
[0022]E1.SEQ ID NO.3所示序列第4915位
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第7008位的cDNA分子或DNA分子;
[0023]E2.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.DSB
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PE基因编辑系统,其特征在于,包括融合蛋白和pegRNA;所述pegRNA依次由spacer、scaffold尾端碱基、靶点序列以及PBS组成,靶点序列与scaffold尾端碱基及其互补配对碱基之间不包括逆转录模板;所述融合蛋白为野生型Cas9切刻酶与逆转录酶RT融合所形成。2.根据权利要求1所述DSB
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PE基因编辑系统,其特征在于,所述scaffold尾端碱基为A1、A2或A3:A1.将如SEQ ID NO.3所示的pegRNA序列第82
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96位替换为ABaccgagtcggtCD得到的RNA分子;其中,CD序列为目标插入序列末尾两个碱基的反向互补序列,A序列为D序列的互补配对序列,B序列为C序列的互补配对序列;A2.将所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子;A3.与A1或A2限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性且具有相同功能的RNA分子。3.根据权利要求1所述DSB
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PE基因编辑系统,其特征在于,所述野生型Cas9切刻酶为B1或B2:B1.氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的蛋白质;B2.将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。4.根据权利要求3所述DSB
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PE基因编辑系统,其特征在于,所述野生型Cas9切刻酶的编码基因为C1、C2或C3:C1.SEQ ID NO.3所示序列第715位
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第4815位的cDNA分子或DN...
【专利技术属性】
技术研发人员:田瑞,
申请(专利权)人:珠海舒桐医疗科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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