一种具有扩大的PAM识别范围的融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种具有扩大的PAM识别范围的融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供的融合蛋白，其包含：a)来自xCas9的非PI结构域的氨基酸序列；b)来自SpCas9变体的PI结构域的氨基酸序列。所述融合蛋白具有更宽松的PAM限制且明显提高的编辑效率，是一种具有扩大靶向范围的新型编辑工具。有扩大靶向范围的新型编辑工具。有扩大靶向范围的新型编辑工具。

【技术实现步骤摘要】
一种具有扩大的PAM识别范围的融合蛋白及其应用
[0001]本申请要求2022年1月17日提交的中国专利技术专利申请CN202210047419.7“一种融合蛋白在碱基编辑中的应用”的优先权，该优先权专利技术专利申请以引用方式全文并入。


[0002]本专利技术涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种具有扩大的PAM识别范围的融合蛋白及其应用。

技术介绍

[0003]簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)与CRISPR相关蛋白(Cas)一起构成了微生物适应性免疫系统，以保护微生物不受入侵噬菌体和质粒的影响。而PAM(原间隔序列临近基序)在免疫获取和目标识别方面发挥着重要作用。利用CRISPR系统的目标识别机制来编辑期望的靶点，可实现对多种生物的基因编辑。在已发现的CRISPR系统中，源于化脓性链球菌的Cas9系统(SpCas9)因其在哺乳动物细胞中的简单性和高效性，成为应用最广泛的基因编辑系统。
[0004]通常，野生型SpCas9识别富含嘌呤的PAM，偏爱NGG PAM(其中N＝A、T、G或C)，从而限制了其目标识别范围。结构研究发现，PI结构域(特别是β5
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β7片)负责PAM的序列特异性结合。为了改变SpCas9的PAM偏好性，根据SpCas9的结构特征，一组在PI结构域内包含某些氨基酸替换的SpCas9变体被设计出来。通过蛋白质工程，几个变体实现了新的PAM特异性。例如，VQR、EQR和VRER SpCas9变体，分别将PAM的特异性从NGG改为NGA、NGAG或NGCG。non<br/>‑
G SpCas9s包括SpCas9
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NRRH、SpCas9
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NRTH和SpCas9
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NRCH，其共同识别NRNH PAM(其中R＝A或G，H＝A、C或T)。其他变体，包括Cas9
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NG和SpRY，分别将PAM的限制性从NGG放宽到NGN和NNN(NRN&gt;NYN PAMs)。以上这些变体的突变大部分集中在PI结构域。

技术实现思路

[0005]第一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：a)来自xCas9的非PI结构域的氨基酸序列；b)来自SpCas9变体的PI结构域的氨基酸序列。
[0006]进一步地，所述SpCas9变体包括Cas9
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NG、non
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G SpCas9或SpRY。
[0007]进一步地，所述non
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G SpCas9包括SpCas9
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NRRH、SpCas9
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NRCH和SpCas9
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NRTH中的一种或多种。
[0008]进一步地，所述来自xCas9的非PI结构域的氨基酸序列包含以下突变：A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I。
[0009]进一步地，所述来自Cas9
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NG的PI结构域的氨基酸序列包含以下突变：R1335V/L1111R/D1135V/G1218R/E1219F/A1322R/T1337R突变。
[0010]进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:114中的一种或多种。
[0011]进一步地，所述融合蛋白进一步包括异源功能结构域。
[0012]进一步地，所述异源功能结构域为脱氨酶结构域。
[0013]进一步地，所述脱氨酶结构域包括腺嘌呤脱氨酶或胞嘧啶脱氨酶。
[0014]第二方面，本专利技术提供了一种提高碱基编辑效率和/或扩大PAM识别范围的方法，其特征在于，所述方法包括将来自xCas9的非PI结构域和来自SpCas9变体的PI结构域耦联。
[0015]进一步地，所述来自xCas9的非PI结构域的氨基酸序列包含以下突变：A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I。
[0016]进一步地，所述SpCas9变体包括Cas9
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NG、non
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G SpCas9或SpRY。
[0017]进一步地，所述non
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G SpCas9包括SpCas9
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NRRH、SpCas9
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NRCH和SpCas9
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NRTH中的一种或多种。
[0018]本专利技术提供的上述方法可以提高Cas9
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NG在NRN PAM的编辑效率，可以提高non
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G SpCas9和SpRY在NRN PAM的编辑效率(其中R＝A或G)。本专利技术提供的上述方法可以将Cas9
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NG的PAM识别范围扩大至TTAH、TTCV、TTTA、CTTC、YCAM、TCAT、NCCC、MCCA和TCTC PAM(其中H＝A、C或T；V＝A、C或G；Y＝T或C；M＝A或C)，可以将SpCas9
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NRRH的PAM识别范围扩大至TAHD、AAYT、AAAG、SACG和GACA PAM(其中H＝A、C或T；Y＝T或C；S＝G或C)，可以将SpCas9
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NRCH扩大至TTTN、TTMR、MTCA、CTAG、ATCG、TCHA、HCYG、BCAG、CCCA PAM(其中N＝A、T、C或G；M＝A或C；H＝A、C或T；Y＝T或C；B＝G、T或C)。
[0019]第三方面，本专利技术还提供了上述融合蛋白在基因编辑中的用途。
[0020]进一步地，所述用途包括通过体内或体外递送所述融合蛋白或编码所述融合蛋白的核苷酸序列来改变靶细胞的基因序列，以开发基因治疗药物和/或细胞治疗药物。
[0021]有益效果
[0022]本专利技术将xCas9的非PI结构域的突变部分和SpCas9变体(SpCas9
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NG、SpCas9
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NRRH、SpCas9
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NRCH、SpCas9
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NRTH和SpRY)PI结构域的突变部分融合，构建出新的突变体(xCas9
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NG、xCas9
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NRRH、xCas9
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NRCH、xCas9
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NRTH和xCas9
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RY)，即融合蛋白。所述融合蛋白比xCas9、Cas9
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NG、non
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G SpCas9和SpRY都有更宽松的PAM限制，且碱基编辑效率明显提高，例如Cas9
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NG PAM识别范围由NG扩大为NR，xCas9
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NG明显提高了含有NAN PAM的编辑效率；non
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G SpCas9和SpRY也提高了在NRN PAM的编辑效率，且non
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G SpC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含：a)来自xCas9的非PI结构域；b)来自SpCas9变体的PI结构域。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述SpCas9变体包括Cas9
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NG、non
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G SpCas9或SpRY，所述non
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G SpCas9可选地包括SpCas9
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NRRH、SpCas9
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NRCH和SpCas9
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NRTH中的一种或多种。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述来自xCas9的非PI结构域的氨基酸序列包含以下突变：A262T/R324L/S409I/E480K/E543D/M694I。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:114中的一种或多种。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白进一步包括异源功能结构域，所述异源功能结构域可选地为脱氨酶结...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚少华，解丽芳，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：