工程化CAS9核酸酶及其使用方法技术

公开了SaCas9蛋白质变体、编码此类变体的构建体、包含此类变体和构建体的组合物，以及使用变体、构建体和组合物的方法。在一些形式中，所公开的变体包含突变Y239H且不包含突变R245A。还公开了编码任何所公开变体的构建体以用于在所关注的宿主中表达变体。还公开了编辑所关注的序列的方法。辑所关注的序列的方法。

【技术实现步骤摘要】
aureus)衍生的CRISPR酶SaCas9进行的研究较少，但SaCas9拥有小于SpCas9的重要优势，即，使其能够使用腺相关病毒载体进行有效包装用于体内基因编辑和基因疗法应用的特性。
[0008]据报道，SaCas9以与SpCas9相似的效率编辑人基因组(Ran等人,Nature,520,186
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191,doi:10.1038/nature14299(2015))。使用SaCas9进行基因组编辑需要其靶位点含有更长的PAM位点(即“NNGRRT”)。为了克服该限制，对SaCas9进行了若干突变研究以拓宽其PAM识别(Kleinstiver等人,Nat Biotechnol,33,1293
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1298,doi:10.1038/nbt.3404(2015)；Ma等人,Nat Commun,10,560,doi:10.1038/s41467
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019
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08395
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8(2019)；Luan等人,J Am Chem Soc,141,6545
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6552,doi:10.1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SaCas9变体，其包含突变Y239H且不包含突变R245A。2.根据权利要求1所述的变体，其还包含突变E782K、N968K和R1015H。3.根据权利要求1或2所述的变体，其中所述变体不包括任何其它突变或其它突变的组合，使得在具有表达具有序列CACCTACGGCAATCTGACCCTGAAGT(SEQ ID NO:1)的脱靶sgRNA的报告构建体的OVCAR8
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ADR细胞、SK
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N
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MC细胞和/或MHCC97L细胞中，在第15天在GFP破坏测定中，所述变体比SaCas9变体v3.2具有更大的脱靶活性，其中所述SaCas9变体v3.2仅具有突变N419D、R654A、G655A、E782K、N968K和R1015H。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的变体，其中所述变体不包括任何其它突变或其它突变的组合，使得在具有表达具有序列CACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGT(SEQ ID NO:2)的在靶sgRNA的报告构建体的OVCAR8
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ADR细胞、SK
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N
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MC细胞和/或MHCC97L细胞中，在第15天在GFP破坏测定中，所述变体具有小于SaCas9变体KKH
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SaCas9的在靶活性的0.5的在靶活性，其中所述SaCas9变体KKH
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SaCas9仅具有突变E782K、N968K和R1015H。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的变体，其还包含一种或多种选自下组的突变：T238A、T392A、N394T、N394A、N413A、Q414R、N419A、N419D、N419S、N419G、R499A、Q500A、Y651H、R654A和G655A。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的变体，其包括突变N419D。7.根据权利要求1
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5中任一项所述的变体，其包括突变N419S。8.根据权利要求1
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5中任一项所述的变体，其包括突变N419G。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的变体，其包括突变R499A。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的变体，其包括突变Q500A。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的变体，其包括突变Y651H。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的变体，其包括突变R654A。13.根据权利要求1
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12中任一项所述的变体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兆麟，袁紫璐，
申请(专利权)人：肿瘤及免疫学研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：