工程化CAS9核酸酶及其使用方法技术

公开了SaCas9蛋白质变体、编码此类变体的构建体、包含此类变体和构建体的组合物，以及使用变体、构建体和组合物的方法。在一些形式中，所公开的变体包含突变Y239H且不包含突变R245A。还公开了编码任何所公开变体的构建体以用于在所关注的宿主中表达变体。还公开了编辑所关注的序列的方法。辑所关注的序列的方法。

【技术实现步骤摘要】
aureus)衍生的CRISPR酶SaCas9进行的研究较少，但SaCas9拥有小于SpCas9的重要优势，即，使其能够使用腺相关病毒载体进行有效包装用于体内基因编辑和基因疗法应用的特性。
[0008]据报道，SaCas9以与SpCas9相似的效率编辑人基因组(Ran等人,Nature,520,186
‑
191,doi:10.1038/nature14299(2015))。使用SaCas9进行基因组编辑需要其靶位点含有更长的PAM位点(即“NNGRRT”)。为了克服该限制，对SaCas9进行了若干突变研究以拓宽其PAM识别(Kleinstiver等人,Nat Biotechnol,33,1293
‑
1298,doi:10.1038/nbt.3404(2015)；Ma等人,Nat Commun,10,560,doi:10.1038/s41467
‑
019
‑
08395
‑
8(2019)；Luan等人,J Am Chem Soc,141,6545
‑
6552,doi:10.1021/jacs.8b13144(2019))，并且KKH
‑
SaCas9是识别“NNNRRT”PAM位点的经鉴定变体之一。该变体可用于治疗性基因组编辑，因为它可以编辑含有PAM的位点，所述PAM是其它小型Cas直向同源物，如来自空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)(Kim等人,Nat Commun,8,14500,doi:10.1038/ncomms14500(2017))和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的Cas9(Edraki等人,Mol Cell,73,714
‑
726,doi:(2019))的小型Cas直向同源物，以及Cas12a(Zetsche等人,Cell,163,P759
‑
771,doi:10.1016/j.cell.2015.09.038(2015))和CasΦ(Pausch等人,Science,369,333
‑
337,doi:10.1126/science.abb1400(2020))不能识别的。在编辑保真性方面，在其与靶向或非靶向DNA链和sgRNA相互作用的氨基酸残基处携带突变的特定组合的SaCas9变体(包括SaCas9
‑
HF(Tan等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A,116,20969
‑
20976,doi:10.1073/pnas.1906843116(2019))和eSaCas9(Slaymaker等人,Science,351,84
‑
88doi:10.1126/science.aad5227(2016))显示表现出降低的脱靶活性。SaCas9
‑
HF与eSaCas9之间的比较揭示了它们具有相当的在靶活性(on
‑
target)和全基因组靶向特异性(Tan等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A,116,20969
‑
20976,doi:10.1073/pnas.1906843116(2019))。然而，将来自SaCas9
‑
HF的突变(即，R245A/N413A/N419A/R654A)嫁接到KKH
‑
SaCas9上极大地降低了其靶向许多测试基因靶标的在靶活性(Tan等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A,116,20969
‑
20976,doi:10.1073/pnas.1906843116(2019))。还不存在治疗应用所需的具有高效率和证实的全基因组准确性两者的宽靶向范围的现有SaCas9变体(如KKH
‑
SaCas9)。因此，目前，本领域需要高度特异性和有效的Cas9核酸酶变体，其可以在宽范围的基因组靶标上进行编辑以改善CRISPR
‑
Cas9系统的基因组编辑能力。还需要特异性改善的用于工程化改造较小位点特异性内切核酸酶的技术。
[0009]因此，本专利技术的一个目的是提供具有更精确的在靶编辑和较低的脱靶编辑的较小Cas9核酸酶变体，其能够使用腺相关病毒载体有效包装以用于体内基因编辑和基因疗法应用。
[0010]本专利技术的另一个目的是提供一种用于多结构域组合诱变的方法，该方法采用结构指导的方法来选择突变用于工程化和测试Cas9变体。

技术实现思路

[0011]公开了用于基因组编辑的Cas9蛋白变体。这些核酸酶利用了以下发现：较小的Cas9蛋白可被工程化成在较长PAM位点(即，“NNGRRT”)下具有高在靶活性的高特异性。所公开的内切核酸酶可以使用腺相关病毒载体有效包装以用于体内基因编辑和基因疗法应用。
[0012]公开了SaCas9蛋白质变体、编码此类变体的构建体、包含此类变体和构建体的组合物，以及使用这种变体、构建体和组合物的方法。在一些形式中，所公开的变体包含突变Y239H，且不包含突变R245A。这样的变体可称为Y/H变体。Y/H变体是所公开变体的优选形式。所有最优选的Cas9蛋白变体保留了关键氨基酸置换突变E782K、N968K和R1015H。
[0013]在一些形式中，所公开的变体不包括任何突变或突变的组合，使得该变体具有比对照SaCas9变体或对照Cas9变体更大的脱靶活性。在一些形式中，所公开的变体不包括任何导致该变体具有比SaCas9变体v3.2更大的脱靶活性的突变或突变的组合。在一些形式中，脱靶活性在GFP破坏测定中测量。在一些实施方案中，在第15天进行测量。在一些形式中，测定在具有表达脱靶sgRNA的报告构建体的细胞中执行。在一些形式中，具有表达脱靶sgRNA的报告构建体的细胞是OVCAR8
‑
ADR。在一些形式中，具有表达脱靶sgRNA的报告构建体的细胞是MHCC97L细胞。在一些形式中，具有表达脱靶sgRNA的报告构建体的细胞是SK
‑
N
‑
MC细胞。在一些形式中，脱靶sgRNA具有序列CACCTACGGCAATCTGACCCTGAAGT(SEQ ID NO:1)。在一些形式中，对照SaCas9变体包含突变N419D、R654A、G655A、E782K、N968K和R1015H。在一些形式中，对照SaCas9变体仅具有突变N419D、R654A、G655A、E782K、N968K和R1015H。在一些形式中，SaCas9变体是变体(v)3.2。
[0014]在一些形式中，所公开的变体不包括任何其它突变或其它突变的组合，使得在具有表达具有序列CACCTACGGCAATCTGACCCTGAAGT(SEQ IDNO:1)的脱靶sgRNA的报告构建体的OVCAR8
‑
ADR细胞中，在第15天在GFP破坏测定中，该变体具有比SaCas9变体v3.2更大的脱靶活性，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SaCas9变体，其包含突变Y239H且不包含突变R245A。2.根据权利要求1所述的变体，其还包含突变E782K、N968K和R1015H。3.根据权利要求1或2所述的变体，其中所述变体不包括任何其它突变或其它突变的组合，使得在具有表达具有序列CACCTACGGCAATCTGACCCTGAAGT(SEQ ID NO:1)的脱靶sgRNA的报告构建体的OVCAR8
‑
ADR细胞、SK
‑
N
‑
MC细胞和/或MHCC97L细胞中，在第15天在GFP破坏测定中，所述变体比SaCas9变体v3.2具有更大的脱靶活性，其中所述SaCas9变体v3.2仅具有突变N419D、R654A、G655A、E782K、N968K和R1015H。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的变体，其中所述变体不包括任何其它突变或其它突变的组合，使得在具有表达具有序列CACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGT(SEQ ID NO:2)的在靶sgRNA的报告构建体的OVCAR8
‑
ADR细胞、SK
‑
N
‑
MC细胞和/或MHCC97L细胞中，在第15天在GFP破坏测定中，所述变体具有小于SaCas9变体KKH
‑
SaCas9的在靶活性的0.5的在靶活性，其中所述SaCas9变体KKH
‑
SaCas9仅具有突变E782K、N968K和R1015H。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的变体，其还包含一种或多种选自下组的突变：T238A、T392A、N394T、N394A、N413A、Q414R、N419A、N419D、N419S、N419G、R499A、Q500A、Y651H、R654A和G655A。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的变体，其包括突变N419D。7.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的变体，其包括突变N419S。8.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的变体，其包括突变N419G。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的变体，其包括突变R499A。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的变体，其包括突变Q500A。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的变体，其包括突变Y651H。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的变体，其包括突变R654A。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的变体，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄兆麟，袁紫璐，
申请(专利权)人：肿瘤及免疫学研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：