工程化CAS12B效应蛋白及其使用方法技术

本申请提供了工程化Cas12b核酸酶或其衍生物，其包含一种或多种类型的具有提高的活性(例如，基因编辑活性)或消除的核酸酶活性的突变。还提供了工程化Cas12b效应蛋白、工程化的gRNA(例如sgRNA或tracrRNA)、工程化CRISPR

【技术实现步骤摘要】
工程化CAS12B效应蛋白及其使用方法
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求了下述国际专利申请的优先权：2021年12月9日提交的PCT/CN2021/136761号，其全部内容通过整体引用并入本文。
[0003]电子序列表引用
[0004]电子序列表(253112000541SEQLIST.xml；文件大小111583比特；生成日期：2022年11月22日)的内容通过整体引用并入本文。


[0005]本申请总体上涉及生物
更具体地，本申请涉及具有提高的活性(例如，基因编辑活性)或消除的核酸酶活性的工程化Cas12b效应蛋白和工程化的gRNA支架及其使用方法。

技术介绍

[0006]基因组编辑在基因组研究和各种应用中是重要且有用的技术。各种可用于基因组编辑系统，包括规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)
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Cas系统、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)系统，以及锌指核酸酶(ZFN)系统。
[0007]CRISPR
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Cas系统是一种高效且具有成本效益的基因组编辑技术，广泛适用于从酵母和植物到斑马鱼和人类的一系列真核生物(由VanderOost,2013《科学(Science)》339:768
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770，以及Charpentier和Doudna,2013《自然(Na ture)》495:50
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51综述)。CRISPR
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Cas系统通过采用Cas效应蛋白和CRISPR RNA(crRNA)的组合来在古细菌和细菌中提供适应性免疫。迄今为止，根据系统的显著功能和进化模块性，已经对包括六种类型(I至VI型)的两个类别(1类和2类)的CRISPR
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Cas系统进行了表征。在2类CRISPR
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Cas系统中，II型Ca s9系统和V
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A/B/E/J型Cas12a/Cas12b/Cas12e/Cas12f/Cas12j系统已经被用于基因组编辑，并且为生物医学研究提供了广阔的前景。

技术实现思路

[0008]当前的CRISPR
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Cas系统有各种局限性，包括有限的基因编辑效率。本申请提供了改进的方法和系统，用于跨多基因组位点的有效基因组编辑。特别地，在此提供了具有提高的酶活性的工程化Cas12b核酸酶、工程化Cas12b效应蛋白，包含工程化支架的工程化gRNA(例如sgRNA和tracrRNA)，以及(诸如在基因编辑中)使用工程化Cas12b效应蛋白和/或工程化gRNA的方法。在一个方面，本申请提供了工程化Cas12b核酸酶，其包含相对于参考Cas12b核酸酶的一种、两种，或三种类型的突变，其中所述突变包含：(1)用带正电荷的氨基酸残基(例如R、H、K)取代参考Cas12b核酸酶中与前间区序列邻近基序(PAM)相互作用的一个或多个氨基酸残基；和/或(2)用具有芳环的氨基酸残基(例如F、Y、W)取代参考Cas12b核酸酶中参与打开DNA双链(dsDNA)的一个或多个氨基酸残基；和/或(3)用带正电荷的氨基酸残基(例如R、H、K)或疏水性氨基酸残基(例如F、Y、W)取代参考Cas12b核酸酶的RuvC结构域中与
单链DNA(ssDNA)底物相互作用的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，参考Cas12b核酸酶是野生型Cas12b核酸酶。在一些实施方案中，参考Cas12b核酸酶是来自Alicyclobacillusacidiphilus的Cas12b核酸酶(AaCas12b)。在一些实施方案中，参考Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
[0009]在根据上述工程化Cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化Cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基取代参考Cas12b核酸酶中与PA M相互作用的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，与PAM相互作用的一个或多个氨基酸残基在三维结构中与PAM的距离在10(例如9、8、7、6、5、4、3、2、1或更少)埃内。在一些实施方案中，与PAM相互作用的一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：116、123、130、132、144、145、153、173、222、395、400和475。在一些实施方案中，与PAM相互作用的一个或多个氨基酸残基包含以下氨基酸残基中的一个或多个：D116、K123、D130、D132、N144、K145、E153、D173、Q222、D395、N400，和/或E475。在一些实施方案中，与PAM相互作用的一个或多个氨基酸残基包含以下氨基酸残基中的一个或多个：D116和E475。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸残基是R或K。在一些实施方案中，工程化Cas12b核酸酶包含以下取代中的一种或多种：D116R和E475R。在一些实施方案中，氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。在一些实施方案中，所述工程化的Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。
[0010]在根据上述工程化Cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化Cas12b核酸酶包含用具有芳环的氨基酸残基取代参考Cas12b核酸酶中参与打开DNA双链的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，参与打开DN A双链的一个或多个氨基酸残基与PAM中相对于靶链3'端的最后碱基对相互作用。在一些实施方案中，参与打开DNA双链的一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：118和119。在一些实施方案中，具有芳环的氨基酸残基是Y、F，或W。在一些实施方案中，所述用具有芳环的氨基酸残基取代参考Cas12b核酸酶中参与打开DNA双链的一个或多个氨基酸残基包含Q119Y、Q119F或Q119W。在一些实施方案中，所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。在一些实施方案中，所述工程化Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:4至6的氨基酸序列。
[0011]在根据上述工程化Cas12b核酸酶中的任一种的一些实施方案中，工程化Cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基或疏水性氨基酸残基取代参考Cas12b核酸酶中位于RuvC结构域中并与单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，位于RuvC结构域中并与单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基在三维结构中与单链DNA底物的距离在10(例如9、8、7、6、5、4、3、2、1或更少)埃内。在一些实施方案中，位于RuvC结构域中并与单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：300、301、304、329、636、639、647、682、757、758、761、764、768、852、854、856、857、858、860、862、863、865、866、867、869、938、956、957、958、994、1093和1097。在一些实施方案中，位于RuvC结构域中并与单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基包含以下氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程化Cas12b核酸酶，其包含相对于参考Cas12b核酸酶的一种、两种或三种类型的突变，其中所述突变包含：(1)用带正电荷的氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中与前间隔序列邻近基序(PAM)相互作用的一个或多个氨基酸残基；和/或(2)用具有芳环的氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中参与打开DN A双链的一个或多个氨基酸残基；和/或(3)用带正电荷的氨基酸残基或疏水性氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶的RuvC结构域中与单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述参考Cas12b核酸酶是野生型Cas12b核酸酶。3.根据权利要求1或2所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述参考Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中与PAM相互作用的一个或多个氨基酸残基。5.根据权利要求4所述的工程化Cas12b核酸酶，其中与PAM相互作用的所述一个或多个氨基酸残基在三维结构中与PAM的距离在10埃内。6.根据权利要求4或5所述的工程化Cas12b核酸酶，其中与PAM相互作用的所述一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：116、123、130、132、144、145、153、173、222、395、400和475；且其中氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。7.根据权利要求4至6中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中与PA M相互作用的所述一个或多个氨基酸残基包含以下氨基酸残基中的一个或多个：D116和E475；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。8.根据权利要求4至7中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述带正电荷的氨基酸残基是R或K。9.根据权利要求4至8中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中用所述带正电荷的氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中与PAM相互作用的一个或多个氨基酸残基是以下取代中的一种或多种：D116R和E475R；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。10.根据权利要求1至9中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含用具有芳环的氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中参与打开所述DNA双链的一个或多个氨基酸残基。12.根据权利要求11所述的工程化Cas12b核酸酶，其中参与打开所述DN A双链的所述一个或多个氨基酸残基与PAM中相对于靶链3'端的最后碱基对相互作用。13.根据权利要求11或12所述的工程化Cas12b核酸酶，其中参与打开所述DNA双链的所述一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：118，和119；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。14.根据权利要求11至13中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述具有芳环的
氨基酸残基是Y、F或W。15.根据权利要求11至14中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中用所述具有芳环的氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中参与打开所述DN A双链的一个或多个氨基酸残基是Q119Y、Q119F或Q119W取代；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。16.根据权利要求1至3和11至15中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:4至6中任一项的氨基酸序列。17.根据权利要求1至16中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基或疏水性氨基酸残基取代所述参考Cas12b核酸酶中位于所述RuvC结构域中并与所述单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基。18.根据权利要求17所述的工程化Cas12b核酸酶，其中位于所述RuvC结构域中并与所述单链DNA底物相互作用的所述一个或多个氨基酸残基在三维结构中与所述单链DNA底物的距离在10埃内。19.根据权利要求17或18所述的工程化Cas12b核酸酶，其中位于所述Ru vC结构域中并与所述单链DNA底物相互作用的所述一个或多个氨基酸残基位于以下的一个或多个位置：300、301、304、329、636、639、647、682、757、758、761、764、768、852、854、856、857、858、860、862、863、865、866、867、869、938、956、957、958、994、1093和1097；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。20.根据权利要求17至19中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含用带正电荷的氨基酸残基取代以下氨基酸残基中的一个或多个：E636、Q639、T647、Q682、I757、E758、E761、K768、Q854、N857、D858、N865、Q866、I994、Q869、Q1093和W1097；其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。21.根据权利要求17至20中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述带正电荷的氨基酸残基是R或K。22.根据权利要求17至21中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中取代所述参考Cas12b核酸酶中位于所述RuvC结构域中并与所述单链DNA底物相互作用的一个或多个氨基酸残基是以下取代中的一种或多种：E636R、Q639R、T647R、Q682R、I757R、E758R、E761R、Q854R、N857K、D858R、I994R、Q1093R和W1097R；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。23.根据权利要求1至3和17至22中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:7至13中任一项的氨基酸序列。24.根据权利要求17至19中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含用疏水性氨基酸残基取代以下氨基酸残基中的一个或多个：E758、E761、E863、N865、Q866、Q869、Q956和Q1093；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。25.根据权利要求17至19和24中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述疏水性氨基酸残基是W、Y、F或M。26.根据权利要求17至19、24和25中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中取代所述参考Cas12b核酸酶中位于所述RuvC结构域中并与所述单链DN A底物相互作用的一个或多个氨基酸残基是以下取代中的一种或多种：N865W、N865Y、Q866M、Q869M、Q1093W和Q1093Y；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。
27.根据权利要求1至3、17至19和24至26中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含SEQ ID NO:14至19中任一项的氨基酸序列。28.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含以下取代中的任一种或其组合：(1)D116R；(2)E475R；(3)Q119F+E475R；(4)Q119F+E475R+E758R；(5)Q119Y；(6)Q119F；(7)Q119W；(8)I757R；(9)E758R；(10)E761R；(11)K768R；(12)I757R+E758R；(13)I757R+E761R；(14)I757R+K768R；(15)E758R+E761R；(16)E758R+K768R；(17)E761R+K768R；(18)I757R+E758R+E761R；(19)I757R+E758R+K768R；(20)I757R+E761R+K768R；(21)E758R+E761R+K768R；(22)I757R+E758R+E761R+K768R；(23)Q866M；(24)Q869M；(25)Q866M+Q869M；(26)E636R；(27)Q854R；(28)N857K；(29)N865W；(30)N865Y；(31)Q1093W；(32)Q1093Y；和(33)D858R；且其中所述氨基酸残基根据SEQ ID NO:1编号。29.根据权利要求1至3和28中任一项所述的工程化Cas12b核酸酶，其中所述工程化Cas12b核酸酶包含以下取代中的任一种或其组合：(1)Q866M+Q869M；(2)Q119F+E475R；(3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周琪，陈阳灿，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：