本发明专利技术属于生物医药领域，公开了C2C9核酸酶用作RNA引导的核酸内切酶的用途以及一种极小型基因组编辑系统，所述的基因组编辑系统包括C2C9核酸酶和/或编码所述C2C9核酸酶的核酸，以及引导RNA或编码所述引导RNA的核酸。本发明专利技术所述极小型基因组编辑系统能够对原核细菌和真核细胞基因组中的至少一个靶序列进行基因编辑。本发明专利技术还公开了所述基因组编辑系统的应用以及编辑方法。利用本发明专利技术的基因编辑系统或者方法可以将目标基因精准敲除或切断，切割效率高，实现目标基因的精准编辑。实现目标基因的精准编辑。
【技术实现步骤摘要】
一种基于C2C9核酸酶的新型基因组编辑系统及其应用
[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种基于极小型C2C9核酸酶的新型基因组编辑系统，以及该系统在原核细菌和真核细胞中的基因组编辑方法和应用。
技术介绍
[0002]CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR
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associated protein)是近年来开发的一种新型基因编辑系统。该系统主要由Cas核酸内切酶和相对应的引导RNA所构成。Cas核酸内切酶能够与引导RNA特异性结合，利用碱基互补配对靶向识别并切割基因组特定位点，造成基因组DNA的双链断裂。然后利用生物体内源或外加的DNA修复机制，例如同源重组和非同源重组末端连接的修复机制对断裂的基因组DNA进行修复，从而在修复过程中实现对基因组特定位点的编辑。
[0003]利用CRISPR/Cas系统对细胞或者物种进行遗传学操纵，可广泛的应用于生命科学、医学、农学等领域的基础研究、生物技术开发、以及疾病治疗手段研发。例如：对遗传病或癌症等疾病的突变基因进行矫正；对农作物进行基因工程改造，提升其性能；对微生物基因组进行精准改造，推动高附加值化合物生产；对病原微生物基因组进行切割杀死病原微生物，用于感染治疗等。由于CRISPR/Cas系统的简便性与高效性，已经被广泛应用于医学、生物、农学等领域。
[0004]目前广泛使用的CRISPR/Cas基因组编辑系统主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a两种类型。在这两种类型的基因组编辑系统中，CRISPR效应蛋白核酸酶Cas9和Cas12a均是含有超过1000个氨基酸的大型蛋白，这导致CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a在向细胞递送过程中存在巨大问题。例如，在活体基因治疗过程中，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cas12a系统往往需要被包装入慢病毒载体进行使用。但是慢病毒载体的包装容量有限，这使得CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统的巨大分子尺寸大大限制了慢病毒载体包装效率，增加了包装难度，极大限制这些系统在基因治疗等领域的广泛应用。此外，由于CRISPR/Cas系统识别的原间隔区
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相邻基序(PAM、PAM序列或PAM位点)的有限性，使得能够选择的基因组位点受到限制，影响了其在医学和生物学等领域的深入应用。因此，发现和开发新型高效并且小分子量的基因组编辑系统显得尤为迫切。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供一种极小型基因组编辑系统(包括CRISPR/C2C9系统)及方法。利用本专利技术的基因组编辑系统可以对原核细菌和真核细胞的目标位点进行精确的切割，从而实现基因的精准敲除或者编辑。本专利技术还提供了新颖的RNA
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可编程的内切核酸酶。本专利技术还涉及其它组分，包括引导RNA(gRNA)和/或靶序列，以及在各种应用中产生和使用它们的方法。这样的应用的例子包括用于调节转录的方法，以及使用新颖的核酸酶和其它组分诸如核酸和/或多肽来靶向、编辑和/或操纵基因(如DNA或RNA)的方法。本专利技术还涉及包含所述编辑系统元件的重组细胞和试剂盒等。
[0006]本专利技术一方面提供了一种对基因组中的至少一个靶序列进行基因编辑的基因组编辑系统，其含有：
[0007](a)C2C9核酸酶或编码C2C9核酸酶的核酸；和
[0008](b)引导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸。
[0009]所述C2C9核酸酶和与之匹配的引导RNA形成复合体。
[0010]在一优选实施方式中，所述基因组编辑系统为CRISPR
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C2C9基因组编辑系统。
[0011]在一优选实施方式中，所述CRISPR
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C2C9基因组编辑系统含有：
[0012](1)C2C9核酸酶的表达构建体；
[0013](2)完整引导RNA的表达构建体；
[0014]所述完整引导RNA包含引导RNA骨架，以及在该引导RNA骨架的3
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末端的添加的靶向序列所对应的RNA序列；所述靶向序列为PAM序列之后长度为12～40bp的核酸片段，优选为PAM序列之后长度为20bp的核酸片段。本专利技术中所述的C2C9核酸酶可为本领域常规的C2C9核酸酶。优选地，所述C2C9核酸酶的大小优选不超过800个氨基酸。更优选地，所述C2C9核酸酶来源为下列氨基酸序列之任一或与下列任一氨基酸序列具有至少80％序列同源性：SEQ ID NO.3
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117。在一些实施方式中，所述C2C9核酸酶选自Actinomadura craniellaeC2C9(AcC2C9)、Corynebacterium glutamicumC2C9(CgC2C9)、Rothia dentocariosaC2C9(RdC2C9)以及Micrococcus luteusC2C9(MiC2C9)等构成的群组。
[0015]在本专利技术较佳实施例中，所述的C2C9核酸酶为如序列表中SEQ ID NO.3所示的AcC2C9核酸酶。
[0016]在某些实施方式中，编码所述AcC2C9核酸酶的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。在某些实施方式中，AcC2C9核酸酶的DNA编码序列如序列表中SEQ ID NO.121所示或与SEQ ID NO:121具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同源性的变体。
[0017]在某些实施方式中，编码所述AcC2C9核酸酶的核酸是核糖核酸(RNA)。在某些实施方式中，编码所述C2C9核酸酶的RNA是mRNA。
[0018]在一些实施方式中，编码所述AcC2C9核酸酶的序列为针对人类密码子优化后的编码序列，较佳地如序列表中SEQ ID NO.122所示或与SEQ ID NO:122具有至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同源性的变体。
[0019]在某些实施方式中，将所述C2C9核酸酶或编码C2C9核酸酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在某些实施方式中，所述脂质体或脂质纳米颗粒也包含所述gRNA或编码所述gRNA的核酸。
[0020]在某些实施方式中，所述系统包含与gRNA预络合的C2C9核酸酶，从而形成核糖核蛋白(RNP)复合物，其识别靶基因(如靶DNA)序列上的PAM序列；即精确定位DNA序列侧翼包括C2C9核酸酶和引导RNA形成的复合体识别靶基因上的PAM序列。
[0021]其中，所述AcC2C9核酸酶的引导RN本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.C2C9核酸酶用作RNA引导的核酸内切酶的用途。2.C2C9核酸酶或编码所述C2C9核酸酶的核酸在基因编辑系统中的用途。3.一种基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括C2C9核酸酶和/或编码所述C2C9核酸酶的核酸，以及引导RNA或编码所述引导RNA的核酸。4.如权利要求3所述的基因编辑系统，其特征在于，所述C2C9核酸酶是：(I)野生型C2C9核酸酶或其片段，具有受RNA引导的核酸结合活性；(II)与(I)的氨基酸序列具有至少50％序列同源性的变体，且具有受RNA引导的核酸结合活性；(III)根据(I)或(II)，其进一步包括核定位信号片段；(IV)根据(I)或(II)或(III)，其进一步包含：(a)一种或多种修饰或突变，其产生具有相比修饰或突变前显著减小的核酸内切酶活性，或使核酸内切酶活性丧失；和/或(b)具有其他功能活性的多肽或结构域；(V)根据(I)或(II)或(III)，所述C2C9核酸酶具有核酸内切酶活性。5.如权利要求3或4所述的基因编辑系统，其特征在于，所述C2C9核酸酶不超过800个氨基酸；和/或，所述C2C9核酸酶具有受RNA引导的核酸结合活性。6.如权利要求3
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5任一所述的基因编辑系统，其特征在于，所述的基因编辑系统识别靶向序列上的PAM序列；和/或，所述基因编辑系统靶向PAM序列之后长度为12～40bp的核酸片段，优选的长度为20bp。7.如权利要求6所述的基因编辑系统，其特征在于，所述PAM序列为AAN，GAN；其中N为简并碱基，代表A、T、C或G任意碱基。8.如权利要求3
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7任一所述的基因编辑系统，其特征在于，所述的C2C9核酸酶从N端到C端包含：结构域1，其包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少50％序列同一性的变体；具有受RNA引导的核酸结合活性和/或核酸内切酶活性；结构域2，其包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有至少50％序列同一性的变体，且具有受RNA引导的核酸结合活性和/或核酸内切酶活性。9.如权利要求3
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7任一所述的基因编辑系统，其特征在于，所述C2C9核酸酶为SEQ ID NO.3
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117所示的氨基酸序列之任一或与SEQ ID NO.3
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117所示的任一氨基酸序列具有至少50％序列同源性，且具有受RNA引导的核酸结合活性和/或核酸内切酶活性。10.如权利要求3
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7任一所述的基因编辑系统，其特征在于，所述引导RNA包含：能够与靶序列杂交的基因靶向区段(i)，tracr配对物序列(ii)，tracr RNA序列(iii)；其中，所述tracr配对物序列(ii)与所述tracrRNA序列(iii)杂交，并形成茎
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环结构；所述引导RNA为一条链，其由所述核酸靶向区段(i)与tracr配对物序列(ii)和tracr RNA序列(iii)依次连接形成；或，所述引导RNA包括两条链，其中一条链由所述基因靶向区段(i)...
【专利技术属性】
技术研发人员：季泉江，陈未中，马佳诚，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：
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