一类新型的Cas酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种新型的Cas酶，所述Cas酶属于一类新型的Cas蛋白，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一类新型的Cas酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术筛选到了一类新型的Cas酶，并基于该新型Cas酶开发了相应的基因编辑工具及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
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NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
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TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0004]总之，鉴于目前可获得的CRISPR/Cas系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的、具有多方面良好性能的新型CRISPR/Cas系统对生物技术的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种新型核酸内切酶(Cas酶)。基于这一发现，本专利技术人开发了新的CRISPR/Cas系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法。
[0006]Cas效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一类新型的Cas蛋白，所述Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白，本专利技术中将其称之为CasN蛋白。
[0008]本专利技术所述的CasN蛋白与已报道的Cas蛋白的序列一致性较低，通过与其他类别的Cas酶构建进化树，发现这些Cas酶非常显著地属于一个独立的进化分支，且与其他蛋白距离较远，属于一种新的Cas蛋白的分支。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种CasN蛋白，所述CasN蛋白包含以下一种或两种保守结构域：
[0010]第一保守结构域的氨基酸为：X1NX2X3X4EX5X6X7X8X9X10；其中，X1＝D/K/N/P，X2＝F/L/Y，X3＝A/G/L/P/Q/V，X4＝D/F/H/Y，X5＝I/L/T/V，X6＝A/V，X7＝H/K/N/R/T/V/W，X8＝A/Q/R，X9＝I/L/M，X10＝I/L/V；
[0011]第二保守结构域的氨基酸为：X11X12X13X14X15EX16X17；其中，X11＝A/M/Y，X12＝
F/I/L/M/S/V/Y，X13＝I/V，X14＝A/C/G，X15＝I/L/V，X16＝D/H/N/R/Y，X17＝A/G/T。
[0012]在一个实施方式中，所述第一保守结构域的氨基酸为：X1NX2X3X4EX5X6X7X8X9X10；其中，X1＝D/N/P，X2＝Y，X3＝A/V，X4＝D/F/Y，X5＝T/V，X6＝A/V，X7＝H/K/T，X8＝A，X9＝I/L/M，X10＝I/V。
[0013]在一个实施方式中，所述第二保守结构域的氨基酸为：X11X12X13X14X15EX16X17；其中，X11＝A/M，X12＝I/L/M/V，X13＝I，X14＝G，X15＝I/L，X16＝D/H/R，X17＝A/G/T。
[0014]本专利技术中的CasN蛋白包括CasN
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1、CasN
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3、CasN
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4、CasN
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6、CasN
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7，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
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5所示。
[0015]在一些实施方式中，所述CasN蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1
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5任一氨基酸序列相比，具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。
[0016]在一个实施方式中，所述CasN蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1
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5任一序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；所述一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。
[0017]在一些实施例中，本专利技术的CasN蛋白能够识别前间隔子相邻基序(PAM)，并且靶核酸包括PAM或由PAM组成。
[0018]本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本专利技术的范围内。因此，本专利技术的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本专利技术也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本专利技术的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
[0019]保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白为CasN蛋白，所述CasN蛋白包含以下一种或两种保守结构域：第一保守结构域：X1NX2X3X4EX5X6X7X8X9X10；其中，X1＝D/K/N/P，X2＝F/L/Y，X3＝A/G/L/P/Q/V，X4＝D/F/H/Y，X5＝I/L/T/V，X6＝A/V，X7＝H/K/N/R/T/V/W，X8＝A/Q/R，X9＝I/L/M，X10＝I/L/V；第二保守结构域：X11X12X13X14X15EX16X17；其中，X11＝A/M/Y，X12＝F/I/L/M/S/V/Y，X13＝I/V，X14＝A/C/G，X15＝I/L/V，X16＝D/H/N/R/Y，X17＝A/G/T；优选的，所述CasN蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1
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5任一氨基酸序列相比，具有至少80％的序列同一性。2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的Cas蛋白和其他的修饰部分。3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。4.一种gRNA，其特征在于，所述gRNA能够结合权利要求1所述的Cas蛋白，所述gRNA包括tracrRNA和crRNA，所述tracrRNA和crRNA能够配对形成双链体，所述crRNA包括与tracrRNA的配对区以及靶向核酸的靶向序列。5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。6.一种CRISPR
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Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的Cas蛋白以及至少一种能够与所述Cas蛋白结合的gRNA，所述gRNA包括与所述Cas蛋白结合的区域以及靶向核酸的靶向序列。7.一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与gRNA连接，所述gRNA包括与权利要求1所述Cas蛋白结合的区域以及靶向核酸的靶向序列；b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与权利要求1所述的Cas蛋白连接；其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其选自：gRNA，或编码所述gRNA的核酸，或所述gRNA的前体RNA，或编码所述gRNA的前体RNA核酸；所述gRNA包括与权利要求1所述Cas蛋白结合的区域以及靶向核酸的靶向序列；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。9.一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其选自：gRNA，或编码所述gRNA的核酸，或所述gRNA的前体RNA，或编码所述gRNA的前体RNA核酸；所述gRNA包括与权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：