Cas9蛋白、含有Cas9蛋白的基因编辑系统及应用技术方案

本发明专利技术涉及基因编辑技术领域，具体地涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统以及其应用。本发明专利技术基因编辑系统涉及三种特定的Cas9蛋白——SauriCas9

【技术实现步骤摘要】
Cas9蛋白、含有Cas9蛋白的基因编辑系统及应用


[0001]本申请涉及基因编辑
，具体地涉及Cas9蛋白、含有该Cas9蛋白的基因编辑系统及其相关应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。CRISPR/Cas9系统含有tracrRNA(trans
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activating RNA)和crRNA(CRISPR
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derived RNA)，它们和Cas9共同形成复合物发挥功能。tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)。当DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(Non
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homologous end
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joining，NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)。NHEJ修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas9蛋白，所述Cas9蛋白为：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的SauriCas9
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HF蛋白，或具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少80％的序列同一性并且保留其生物学活性的氨基酸序列的同源物；具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的Sha2Cas9
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HF蛋白，或具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少80％的序列同一性并且保留其生物学活性的氨基酸序列的同源物；或者具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的Sa
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SlugCas9
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HF蛋白，或具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列至少80％的序列同一性并且保留其生物学活性的氨基酸序列的同源物。2.一种缀合物，所述缀合物包含：a)权利要求1所述的Cas9蛋白；b)修饰部分；例如，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测标记或其组合；例如，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及c)任选的用于连接所述Cas9蛋白与所述修饰部分的接头；例如，所述接头为长度为1
‑
50个氨基酸的接头。3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：a)权利要求1所述的Cas9蛋白；b)另外的蛋白和多肽；例如，选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及c)任选的用于连接所述Cas9蛋白与所述另外的蛋白和多肽的接头；例如，所述接头为长度为1
‑
50个氨基酸的接头。4.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含编码以下的核酸序列：a)权利要求1所述的Cas9蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白。5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子还包含编码单链向导RNA的核酸序列；所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列具有：(i)SEQ ID NO:7所示的核酸序列；(ii)与SEQ ID NO:7所示的核酸序列至少90％的序列同一性且保留其生物学活性的核酸序列；或者(iii)基于SEQ ID NO:7所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列；其中，所述改造例如为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化、序列的缩短和序列的加长中的一种或者多种；所述序列的缩短和所述序列加长例如包括相对于基础序列存在1
‑
10个碱基的缺失或者添加；例如，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO：8所示的核酸序列或其简并序列。6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，其中，所述单链向导RNA在所述支架序列的
5
′
端进一步包括CRISPR间隔序列，所述CRISPR间隔序列为长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸(优选21个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。7.一种载体，所述载体包含编码以下的核酸序列：a)权利要求1所述的Cas9蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白；例如，所述载体包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：6中任一个所述的核酸序列或其简并序列；例如，所述载体为质粒载体例如pUC19载体、附着体载体、pAAV2_ITR载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。8.根据权利要求7所述的载体，其中，所述载体进一步包含编码单链向导RNA的核酸序列；所述单链向导RNA包括支架序列，所述支架序列具有：(i)SEQ ID NO:7所示的核酸序列；(ii)与SEQ ID NO:7所示的核酸序列至少90％的序列同一性且保留其生物学活性的核酸序列；或者(iii)基于SEQ ID NO:7所述的核酸序列改造得到的且保留其生物学活性的核酸序列；其中，所述改造例如为碱基磷酸化、碱基硫化、碱基甲基化、碱基羟基化、序列的缩短和序列的加长中的一种或者多种；所述序列的缩短和所述序列加长例如包括相对于基础序列存在1
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10个碱基的缺失或者添加；例如，所述载体包含SEQ ID NO：8所示的核酸序列或其简并序列。9.根据权利要求8所述的载体，其中，所述单链向导RNA在所述支架序列的5
′
端进一步包括CRISPR间隔序列，所述CRISPR间隔序列为长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸(优选21个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。10.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永明，陶晨，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：