一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法，属于生物技术领域。本发明专利技术富集方法基于可编程核酸酶的特异性切割，通过设计和优化sgRNA、guide DNA或guide RNA，使用sgRNA、guide DNA或guide RNA和Cas蛋白或Ago蛋白形成核糖核蛋白复合物（ribonnucleoprotein），能够在恒温扩增的同时不断特异地去除非目标核酸，让样品中目标核酸的数量连续不断地呈指数增加，从而富集或检测低丰度突变基因或甲基化DNA等目标核酸。低丰度突变基因或甲基化DNA等目标核酸。低丰度突变基因或甲基化DNA等目标核酸。

【技术实现步骤摘要】
一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于可编程核酸酶的超灵敏目标核酸富集检测方法。

技术介绍

[0002]体细胞突变与肿瘤发生密切相关，突变检测对疾病早期筛查、精准治疗决策、复发监测具有重要意义。近年来，以液体活检为代表的非侵入性诊断成为一种趋势。液体活检通过检测体液中来源于肿瘤的游离核酸片段，分析肿瘤的基因型，具有无创性、易于实现动态监测等优势。然而，液体活检面临如下问题：1）突变核酸与野生型核酸具有较高的序列同源性，通常只有单个或几个核苷酸的差别，对于在大量游离的野生型等位基因中鉴定出低丰度的突变等位基因提出了挑战；2）对于体液中低丰度甲基化基因的检测也面临同样问题，甲基化基因与非甲基化基因序列相同，只存在碱基修饰的差异，对于在大量游离的非甲基化基因中鉴定出低丰度的甲基化基因提出了挑战。
[0003]目前突变等位基因的高灵敏检测通常使用下一代测序（NGS）或依赖数字PCR的蛮力计数来检测微弱的信号。尤其在微小残留病灶（MRD）检测中，针对极低丰度的突变基因，主要基于超深度（50000X）NGS测序，存在费用高，耗时长，难以普及到临床的问题。因此，亟需开发一种低成本的超灵敏极低丰度突变等位基因检测方法，以促进临床应用。
[0004]近年来，基于CRISPR
‑
Cas可编程核酸酶的诊断技术成为研究热点。CRISPR
‑
Cas系统是古细菌和大多数细菌在生物进化过程中抵御病毒入侵而形成的一种适应性免疫防御系统，由Cas效应蛋白和向导RNA组成，在向导RNA的引导下，Cas蛋白识别并切割含有5
’
端PAM位点的靶序列。基于CRISPR
‑
Cas的低丰度突变等位基因检测方法，旨在通过特殊的向导RNA设计，使Cas蛋白特异性切割野生型等位基因，去除大量的野生型核酸，保留突变等位基因，以提高下游分析的灵敏度。同时，也有研究者基于Argonaute蛋白（Ago），通过和guide DNA形成复合物，建立了类似的低丰度突变等位基因检测方法。
[0005]Cas蛋白的切割受PAM位点的限制，当突变导致PAM位点的破坏时，在同一样品中，Cas蛋白靶向切割大量的野生型核酸，而保留突变核酸。已有研究者针对位于PAM位点的突变，分别开发了DASH（Depletion of Abundant Sequences by Hybridization）和CUT
‑
PCR等低丰度突变等位基因检测方法。Argonaute蛋白不受PAM位点的限制，已有研究者开发了NAVIGATER（NucleicAcid enrichmentVia DNAGuidedArgonaute fromThermus thermophilus）低丰度突变等位基因检测方法。
[0006]DASH法和CUT
‑
PCR虽然在一定程度上提高了下游分析的灵敏度，但现有的基于可编程核酸内切酶检测方法的有效性因酶和靶标之间的无效结合事件受到影响，由于cas9的解离效率非常缓慢，使得部分野生型等位基因靶标受到保护而不被切割，同时非特异的脱靶切割会耗尽极稀少的突变型等位基因。NAVIGATER也存在类似问题。为了克服这些缺点，研究人员采用了多轮选择性切割野生型等位基因，然后进行聚合酶链反应，使突变型等位基因的片段富集10倍。尽管有了这些改进，突变等位基因检测的高灵敏度仍然需要使用下
一代测序技术(next generation sequencing，NGS)或依赖于数字PCR，使得这些方法费力、耗时和昂贵。
[0007]对于液体活检中的低丰度甲基化基因检测，以上技术存在类似问题，也难以满足要求。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种基于可编程核酸酶的超灵敏肿瘤相关基因富集方法，使用本专利技术方法能够高效对低丰度突变基因以及甲基化基因进行富集，同时利用微流控芯片技术使本专利技术方法能够自动化。
[0009]为达到上述专利技术目的，采用如下技术方案：一种核糖核蛋白复合物，包括：组分（a），包含能够与靶核酸互补配对的核酸区域和0
‑
4bp错配片段；或能够与靶核酸互补配对的核酸区域且相邻PAM包括易突变位点；组分（b），能够与靶核酸结合并使靶核酸链断裂；其中，组分（a）选自选自tracrRNA和/或crRNA和/或sgRNA和/或tracrRNA衍生物和/或crRNA衍生物和/或sgRNA衍生物和/或guide DNA和/或guide RNA ；组分（b）包括Cas蛋白和/或Cas蛋白衍生物和/或Ago蛋白和/或Ago蛋白衍生物；组分（a）和（b）能够结合。优选地，组分（a）可携带标记，标记包括链霉亲和素或生物素。
[0010]优选地，错配的核苷酸片段长度为0bp 或1bp或2bp或3bp或4bp。
[0011]优选地，组分（a）携带化学修饰，化学修饰包括硫取代氧或甲氧基修饰。
[0012]优选地，组分（a）中sgRNA、guide DNA或guide RNA包括错配核苷酸片段。本专利技术所设计的错配核苷酸片段有利于扩大sgRNA、guide DNA或guide RNA的使用范围，能够使sgRNA、guide DNA或guide RNA识别更多突变。
[0013]优选地，组分（a）中sgRNA相邻的PAM含有肿瘤热点突变位点。
[0014]优选地，组分（a）中sgRNA的spacer序列长度为16
‑
22nt。
[0015]更优选地，sgRNA序列如下所示：UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA（SEQ ID NO.1）；UAGCUACAGUGAACUCUCGA（SEQ ID NO.2）；UAGCUACAGUGAAAUCACGA（SEQ ID NO.3）；GCUACAGUGAACUCUCGA（SEQ ID NO.4）；GUCUAGCUACAGUGAAA（SEQ ID NO.5）；GUCUAGCUGCAGUGAAA（SEQ ID NO.6）；GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC（SEQ ID NO.27）；GGCAGCCGAAGAGCAUGAGC（SEQ ID NO.28）；AAUUUUUGUUUGAGUGGUUG （SEQ ID NO.37）；UCCAGCUGUAUCCAGUAUGU（SEQ ID NO.42）。
[0016]更优选地，guide DNA序列如下所示：正向guide：p
‑
TAGATTTCACTGTAGC
‑3’
（SEQ ID NO.43）；反向guide：p
‑
TTCTAGCTACAGTGAA
ꢀ‑3’
（SEQ ID NO.44）。
[0017]优选地，组分（b）包括以下至少一种：Cas12a，SacCas9，CjCas9，SpCas9，NmCas9，Sp
‑
Cas9 HF1，evoCas9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
MGMT，GSTP1，MIR129
‑
2，LINC01158，CCDC181，PRKCB，TBR1，ZNF781，MARCH11，VWC2，SLC9A3，HOXA7，Septin9，IKZF1，BCAT1，hMLH1，WIF1，CDKN2A，SHOX2，3OST2，ASSF1A，RARb，PITX2，NID2，NEUROG2或HOXA1；所述启动子包括以下基因的启动子中的至少一种：PCDH
‑
10，BRCA1，RASSF1A，ESR1，APC，p14ARF，p16INK4a，DAPK，CDH1，RUNX3，TFPI2，SFRP5，HIC1，PAX5，PGR，THBS1，ESR，COL23A1，C2CD4D，WNT6，OPCML，ZNF154，RARb2，ATM, MGMT，GSTP1，MIR129
‑
2，LINC01158，CCDC181，PRKCB，TBR1，ZNF781，MARCH11，VWC2，SLC9A3，HOXA7，Septin9，IKZF1，BCAT1，hMLH1，WIF1，CDKN2A，SHOX2，3OST2，ASSF1A，RARb，PITX2，NID2，NEUROG2或HOXA1。12.一种用于可编程酶的突变基因的富集的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的核糖核蛋白复合物。13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括恒温切割
‑
扩增反应体系，所述恒温切割
‑
扩增反应体系包括：引物、目的基因、酶和助色基团。14.一种使用权利要求12所述试剂盒进行突变基因的富集的方法，包括如下步骤：收集样品；制备核糖核蛋白复合物；配制反应体系；富集分析。15.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括特异性识别核苷酸片段、错配核苷酸片段；其中，错配的核苷酸片段长度为0
‑
4bp。16.如权利要求15所述的sgRNA，其特征在于，包括如下序列：SEQ ID NO.1：UCUUAAUUCCUUGAUAGCGA；SEQ ID NO.2：UAGCUACAGUGAACUCUCGA；SEQ ID NO.3：UAGCUACAGUGAAAUCACGA；SEQ ID NO.4：GCUACAGUGAACUCUCGA；SEQ ID NO.5：GUCUAGCUACAGUGAAA；SEQ ID NO.6：GUCUAGCUGCAGUGAAA；SEQ ID NO.27：GGCAGCCGAAGGGCAUGAGC；SEQ ID NO.28...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋金召，申月，应杰儿，
申请(专利权)人：杭州逸检科技有限公司，
类型：发明
国别省市：