本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种Cpf1蛋白、V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统及应用。本发明专利技术提供一种Cpf1蛋白和编码所述Cpf1蛋白的核苷酸序列。本发明专利技术提供一种V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，包括所述的Cpf1蛋白、辅助蛋白和CRISPR array。本发明专利技术将所述V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统在原核或真核生物基因编辑中、制备生物基因编辑制剂中应用。本发明专利技术的基因编辑系统扩大了基因编辑工具的种类，丰富了现有Cpf1作为基因编辑工具的PAM多样性，为Cpf1用于临床治疗提供更多的工具选择，对推动将基因编辑应用于临床治疗具有重要的作用。的作用。的作用。
【技术实现步骤摘要】
一种Cpf1蛋白、V型基因编辑系统及应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种Cpf1蛋白、V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统及应用。
技术介绍
[0002]微生物自适应免疫系统CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats/CRISPR
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associated proteins system)帮助细菌和古菌防御外来核酸的入侵。CRISPR/Cas系统包含直接重复序列(Direct Repeat，DR)，这些重复序列由外源DNA的独特间隔序列(Spacer)分离。CRISPR array被转录成长转录物(pre
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crRNA，CRISPR RNA的前体)，然后被加工处理以产生小的成熟的CRISPR RNA(crRNA)，由间隔序列和部分相邻的直接重复组成。crRNA与Cas核酸内切酶形成复合物，在某些情况下，还与辅助Cas蛋白形成复合物并用作靶向和切割外来核酸的指南，从而实现干扰。Cas
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crRNA复合物的DNA识别需要靶位点附近存在原间隔物相邻基序(PAM，Proto
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Spacer Adjacent Motif)，这有助于自我与非自我辨别。CRISPR/Cas系统根据不同蛋白酶数量大致分为两类：I类系统使用多种Cas蛋白的复合物，如Cascade，而II类系统使用单一效应酶，如Cas9、Cas12。
[0003]然而，CRISPR/Cas9系统中因Cas9蛋白通常较大，由约1300个氨基酸组成，常用来进行体内递送的AAV病毒能容纳的最大装载量为4500kb，除了容纳Cas蛋白，还需要装载tracrRNA等其他发挥基因编辑必不可缺的功能元件，这一条件限制了大部分Cas9蛋白无法进行包装递送，而导致其应用困难。此外，Cas9识别富含G的PAM，导致无法编辑一些特定的靶位点，所以在哺乳动物基因组中的靶向范围有限。因此，研发新的基因组编辑系统，以使其在基因编辑的应用上提供更多的可能具有重要意义。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种Cpf1蛋白、V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统及应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0006]第一方面，本专利技术提供一种Cpf1蛋白，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6中任一种序列所示。
[0007]本专利技术的Cpf1蛋白可识别多种不同的PAM序列，只需要识别3位碱基、2位甚至1位碱基的PAM，可靶向的范围更广泛，丰富了现有Cpf1蛋白的PAM多样性，还可极大的提高对特定基因位点进行精准编辑的可能性，为进一步挖掘更多的PAM富含C碱基的新型Cpf1核酸酶提供参考价值，扩充了现有的基因编辑种类。
[0008]第二方面，本专利技术提供种编码所述Cpf1蛋白的核酸，所述核酸的碱基序列如SEQ ID NO.16～21中任一种序列所示。
[0009]第三方面，本专利技术提供一种V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，包括所述的Cpf1蛋白、辅助蛋白和CRISPR array。
[0010]本专利技术的基因编辑系统可以识别各自独特的PAM序列，能够在crRNA的引导下在体外环境和真核细胞中行使基因编辑功能，进一步扩大了基因编辑工具的种类，丰富了现有Cpf1作为基因编辑工具的PAM多样性，为Cpf1用于临床治疗提供更多的工具选择，对推动将基因编辑应用于临床治疗具有重要的作用。
[0011]作为本专利技术所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统的优选实施方式，所述CRISPR array包括直接重复序列和间隔序列；所述直接重复序列和所述间隔序列间隔排列。
[0012]进一步的，所述直接重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10～15中任一种序列所示。
[0013]作为本专利技术所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统的优选实施方式，上述辅助蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7～8中任一种序列所示。
[0014]第四方面，本专利技术将所述V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统在原核或真核生物基因编辑中应用。
[0015]第五方面，本专利技术将所述V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统在制备生物基因编辑制剂中应用。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0017](1)本专利技术通过宏基因组生物信息学分析，首次挖掘出六种全新V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，并预测其各自对应的直接重复序列。6种新型编辑系统的Cpf1蛋白可识别多种不同的PAM序列，只需要识别3位碱基、2位甚至1位碱基的PAM，可靶向的范围更广泛，还可极大的提高对特定基因位点进行精准编辑的可能性，为进一步挖掘更多的PAM富含C碱基的新型Cpf1核酸酶提供参考价值。
[0018](2)本专利技术通过实验证明这六种CRISPR/Cas12a基因编辑系统可以识别各自独特的PAM序列，能够在crRNA的引导下在体外环境和真核细胞中行使基因编辑功能。本专利技术新的六种基因编辑系统的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，丰富了现有Cpf1作为基因编辑工具的PAM多样性，为Cpf1用于临床治疗提供更多的工具选择，对推动将基因编辑应用于临床治疗具有重要的作用。
附图说明
[0019]图1为本专利技术所述CRISPR/Cas12a基因编辑系统由Cas蛋白及CRISPR array的组成示意图。
[0020]图2为本专利技术所述六种CRISPR/Cas12a基因编辑系统的crRNA的二级结构预测图。
[0021]图3为本专利技术所述六种CRISPR/Cas12a基因编辑系统的PAM图。
[0022]图4为本专利技术所述六种CRISPR/Cas12a基因编辑系统的体外切割实验图。
[0023]图5为本专利技术所述六种CRISPR/Cas12a基因编辑系统的真核细胞中发生基因编辑后插入dsODN的PCR检测图。
具体实施方式
[0024]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0025]本专利技术中，所述Cas12a也称为Cpf1，根据同源性将其划分到CRISPR系统2类V型中。效应蛋白Cpf1可以通过与引导RNA的互补性应用于基因组编辑。与Cas9相比，Cas9和Cpf1之间靶DNA识别和切割机制不同，所述的Cpf1具有以下特征：(1)Cpf1由单个crRNA引导，而Cas9使用crRNA和第二种小RNA，即反式激活crRNA(tracrRNA)；(2)Cpf1识别富含T的PAM，与Cas9青睐的富含G的PAM相反；(3)Cpf1在PAM远端靶位点产生交错端，而Cas9在PAM近端靶位点产生钝端，相比而言，C本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种Cpf1蛋白，其特征在于，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～6中任一种序列所示。2.一种编码权利要求1所述Cpf1蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID NO.16～21中任一种序列所示。3.一种V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于，包括如权利要求1所述的Cpf1蛋白、辅助蛋白和CRISPR array。4.根据权利要求3所述的V型CRISPR/Cas12a基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR array包括直接重复序列和间隔序列；所述直接重复序列和所述间隔序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：田瑞，赵停停，
申请(专利权)人：珠海舒桐医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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