Cas12b蛋白、单链向导RNA、包含它们的基因编辑系统及相关应用技术方案

本发明专利技术涉及基因编辑技术领域，具体地涉及一种Cas12b突变体蛋白、单链向导RNA、以及采用它们的CRISPR/Cas12基因编辑系统以及其应用。更具体地，本发明专利技术的Cas12b突变体蛋白与单链向导RNA形成的复合体，能够精确地定位靶向DNA序列并产生切割，使所述靶序列发生双链断裂损伤，具有高的特异性，能够降低细胞中或体外进行基因编辑的脱靶率，并且能够区分出靶位点的单碱基差异，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
Cas12b蛋白、单链向导RNA、包含它们的基因编辑系统及相关应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，具体地涉及一种Cas12b突变体蛋白、与所述蛋白联用的单链向导RNA、包含它们的CRISPR/Cas12b基因编辑系统以及其相关应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas12b系统是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免疫系统。CRISPR/Cas12b系统含有tracrRNA(trans
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activating RNA)和crRNA(CRISPR
‑
derived RNA)，它们与Cas12b共同形成复合物发挥功能。tracrRNA和crRNA通过连接序列可以融合成为单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)。当DNA发生断裂损伤后，细胞内的两种主要DNA损伤修复机制负责修复：非同源末端连接(Non
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homologous end
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joining，NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)。NHEJ修复的结果会引起碱基的缺失或插入，可以进行基因敲除；在提供同源模板的情况下，利用HR修复可以进行基因的定点插入和碱基的精确替换。
[0003]除了基础科研外，CRISPR/Cas12b基因编辑系统还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas基因编辑系统做基因治疗时，最担心的是脱靶问题。脱靶可能会破坏正常基因，导致癌症。大多数CRISPR/Cas都存在脱靶效应。因此，迫切需要提高特异性，减少脱靶。此外，很多显性突变是单碱基突变导致的。如果能将突变的等位基因敲除，只保留正常等位基因，就能达到治疗效果。这就需要CRISPR/Cas系统能区分单碱基突变。目前大多数CRISPR/Cas系统都无法区分单碱基突变。

技术实现思路

[0004]本专利技术人通过反复研究，找到了与野生型ChCas12b蛋白的切割特异性相关的突变位点，由此获得了一系列的Cas12b突变体蛋白，它们都能与单链向导RNA构成有效地进行基因编辑的切割特异性提高的CRISPR/Cas12b基因编辑系统，由此完成了本专利技术。
[0005]综上，在本专利技术的第一方面，提供了一种Cas12b突变体蛋白，所述Cas12b突变体蛋白包含对应于野生型ChCas12b蛋白的R453、D496和R1137中的一个或多个氨基酸残基处的突变。
[0006]在第二方面，本专利技术提供了一种缀合物，所述缀合物包含：
[0007]a)第一方面所述的Cas12b突变体蛋白；
[0008]b)修饰部分；以及
[0009]c)任选的用于连接所述Cas12b突变体蛋白与所述修饰部分的接头。
[0010]在第三方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
[0011]a)第一方面所述的Cas12b突变体蛋白；
[0012]b)另外的蛋白和多肽；以及
[0013]c)任选的用于连接所述Cas12b突变体蛋白与所述另外的蛋白和多肽的接头。
[0014]在第四方面，本专利技术提供了一种单链向导RNA，所述单链向导RNA从5
’
端至3
’
端包括支架序列和CRISPR间隔序列，所述支架序列从5
’
端至3
’
端包括tracrRNA和重复序列，并且具有相对于SEQ ID NO：2所示的核酸序列截短或突变的核酸序列。
[0015]在第五方面，本专利技术提供了一种分离的核酸分子，包含编码以下的核酸序列：
[0016]a)第一方面所述的Cas12b突变体蛋白；
[0017]b)第二方面所述的缀合物；或者
[0018]c)第三方面所述的融合蛋白。
[0019]在第六方面，本专利技术提供了一种分离的核酸分子，包含编码第四方面所述的单链向导RNA的核酸序列。
[0020]在第七方面，本专利技术提供了一种载体，包含编码以下的核酸序列：
[0021]a)第一方面所述的Cas12b突变体蛋白；
[0022]b)第二方面所述的缀合物；或者
[0023]c)第三方面所述的融合蛋白。
[0024]在第八方面，本专利技术提供了一种载体，包含编码第四方面所述的单链向导RNA的核酸序列。
[0025]在第九方面，本专利技术提供了一种CRISPR/Cas12b基因编辑系统，其包含：
[0026]1)蛋白组分，其包含：
[0027]a)第一方面所述的Cas12b突变体蛋白；
[0028]b)第二方面所述的缀合物；或者
[0029]c)第三方面所述的融合蛋白；
[0030]d)野生型ChCas12b蛋白、其缀合物或融合蛋白；
[0031]2)第四方面所述的单链向导RNA的核酸序列，或者包含SEQ ID NO：5所示支架序列的单链向导RNA；
[0032]其中所述蛋白组分在其为d)野生型ChCas12b蛋白、其缀合物或融合蛋白时只能与第四方面所述的单链向导RNA联用；
[0033]并且，所述蛋白组分和所述单链向导RNA相互结合形成复合物。
[0034]在第十方面，本专利技术提供了一种细胞，所述细胞包含：第五方面或第六方面所述的分离的核酸分子、或者第七方面或第八方面所述的载体。
[0035]在第十一方面，本专利技术提供了一种对细胞内或体外环境中的靶序列进行基因编辑的方法，所述方法包括：使以下(1)至(7)中任一项与细胞内或体外环境中的靶序列相接触：
[0036](1)第一方面所述的Cas12b突变体蛋白、第二方面所述的缀合物或者第三方面所述的融合蛋白，以及单链向导RNA；
[0037](2)野生型ChCas12b蛋白、其缀合物或融合蛋白，以及第四方面所述的单链向导RNA；
[0038](3)第五方面所述的分离的核酸分子以及视情况而定的包含编码单链向导RNA的核酸序列的分离的核酸分子；
[0039](4)包含编码野生型ChCas12b蛋白、其缀合物或融合蛋白的分离的核酸分子以及第六方面所述的分离的核酸分子；
[0040](5)第七方面所述的载体以及视情况而定的包含编码单链向导RNA的核酸序列的
载体；
[0041](6)包含编码野生型ChCas12b蛋白、其缀合物或融合蛋白的核酸序列的载体以及第八方面所述的载体；以及
[0042](7)第九方面所述的CRISPR/Cas12b基因编辑系统；
[0043]其中，所述Cas12b蛋白、所述缀合物或所述融合蛋白识别位于靶序列的5
’
端并且具有序列5
’‑
WTN的原间隔邻近序列(PAM)。
[0044]在第十二方面，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于对细胞内或者体外环境中的靶序列进行基因编辑，包括：
[0045]a)选自以下(1)至(7)中的任一项：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas12b突变体蛋白，所述Cas12b突变体蛋白包含对应于野生型ChCas12b蛋白的R453、D496和R1137中的一个或多个氨基酸残基处的突变；优选地，所述突变为选自R453A、D496A和R1137A中的一个或者多个突变，更优选为R453A、D496A或R1137A；优选地，所述Cas12b突变体蛋白与所述野生型ChCas12b蛋白具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。2.一种缀合物，所述缀合物包含：a)权利要求1所述的Cas12b突变体蛋白；b)修饰部分；例如，所述修饰部分选自另外的蛋白或多肽、可检测标记或其组合；例如，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及c)任选的用于连接所述Cas12b突变体蛋白与所述修饰部分的接头，例如长度为1
‑
50个氨基酸的接头。3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：a)权利要求1所述的Cas12b突变体蛋白；b)另外的蛋白和多肽；例如，所述另外的蛋白或多肽选自表位标签、报告蛋白或核定位信号(NLS)序列、胞嘧啶脱氨酶(CBE)、腺嘌呤脱氨酶(ABE)、胞嘧啶甲基化酶DNMT3A和MQ1、胞嘧啶去甲基化酶Tet1、转录激活蛋白VP64、p65和RTA、转录抑制蛋白KRAB、组蛋白乙酰化酶p300、组蛋白去乙酰化酶LSD1、和内切酶FokI中的一种或者多种；以及c)任选的用于连接所述Cas12b蛋白与所述修饰部分的接头，例如长度为1
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50个氨基酸的接头。4.一种单链向导RNA，所述单链向导RNA从5
’
端至3
’
端包括支架序列和CRISPR间隔序列，所述支架序列从5
’
端至3
’
端包括tracrRNA和重复序列，并且具有相对于SEQ ID NO:2所示的核酸序列截短或突变的核酸序列；优选地，所述截短的核酸序列是SEQ ID NO:2第70
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118位核苷酸中的33
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49个核苷酸缺失的核酸序列，更优选地，所述截短的核酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核酸序列；优选地，所述突变的核酸序列是使SEQ ID NO:2所示核酸序列的tracrRNA与所述重复序列形成的至少一个气泡位置处的tracrRNA的一个或多个核苷酸突变的核酸序列，优选地，突变后的核苷酸与所述重复序列对应位置的核苷酸互补配对；更优选地，所述突变的核酸序列包含对应于SEQ ID NO:2所示核酸序列的第70、75和78位核苷酸中的一个或多个突变，优选地，所述突变为选自sgRNA 70U>A、sgRNA 75U>G和sgRNA 78A>G中的一个或多个突变，进一步优选地，所述突变的核酸序列与SEQ ID NO:2有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性；更优选地，所述CRISPR间隔序列为长度为19
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28个核苷酸(优选24个核苷酸)且能够与靶序列互补配对的序列。5.一种分离的核酸分子，包含编码以下的核酸序列：
a)权利要求1所述的Cas12b突变体蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白。6.根据权利要求5所述的分离的核酸分子，还包含编码权利要求4所述的单链向导RNA的核酸序列。7.一种分离的核酸分子，包含编码权利要求4所述的单链向导RNA的核酸序列。8.一种载体，所述载体包含编码以下的核酸序列：a)权利要求1所述的Cas12b突变体蛋白；b)权利要求2所述的缀合物；或者c)权利要求3所述的融合蛋白；例如，所述载体为质粒载体例如pUC19载体、附着体载体、pAAV2_ITR载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。9.根据权利要求8所述的载体，还包含编码权利要求4所述的单链向导RNA的核酸序列。10.一种载体，所述载体包含编码权利要求4所述的单链向导RNA的核酸序列。11.一种CRI...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永明，魏京京，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：