Cas酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种新型的Cas酶，所述Cas酶属于一类新型的Cas蛋白，具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
Cas酶及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术筛选到了一类新型的Cas酶，并基于该新型Cas酶开发了相应的基因编辑工具及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
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NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
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TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0004]总之，鉴于目前可获得的CRISPR/Cas系统都受限于一些缺陷，开发一种更稳健的、具有多方面良好性能的新型CRISPR/Cas系统对生物技术的发展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了一种新型核酸内切酶(Cas酶)。基于这一发现，本专利技术人开发了新的CRISPR/Cas系统以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法。
[0006]Cas效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种Cas蛋白，所述Cas蛋白是CRISPR/Cas系统中的效应蛋白，在本专利技术中，将其称为Cas
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sf2201、Cas
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sf4274、Cas
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sf2771和Cas
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sf2586，上述蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1
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4所示。
[0008]在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1
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4任一序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能。优选的，所述Cas蛋白与Cas
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sf2201、Cas
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sf4274、Cas
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sf2771或Cas
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sf2586来源于同一物种。
[0009]在一个实施方式中，所述Cas蛋白氨基酸序列与SEQ ID No.1
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4任一序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；并且基本保留了其源自的序列的生物学
功能；所述一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。优选的，所述Cas蛋白与Cas
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sf2201、Cas
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sf4274、Cas
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sf2771或Cas
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sf2586来源于同一物种。
[0010]本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本专利技术的范围内。因此，本专利技术的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据下表进行替换而产生。另外，本专利技术也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本专利技术的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
[0011]保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。
[0012][0013][0014]本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从Cas蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本专利技术的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。
[0015]应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备上述蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
[0016]本领域技术人员能够理解，本专利技术Cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r
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DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
[0017]本领域技术人员可以根据本领本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas蛋白，其特征在于，所述Cas蛋白为以下I
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III任一所述的Cas蛋白：I、Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1
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4任一序列相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；II、所述Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1
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4任一序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；III、所述Cas蛋白包含SEQ ID No.1
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4任一所示的氨基酸序列。2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的Cas蛋白和其他的修饰部分。3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述Cas蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求2所述融合蛋白的多核苷酸序列。4.一种gRNA，其特征在于，所述gRNA能够结合权利要求1所述的Cas蛋白。5.一种同向重复序列，其特征在于，所述同向重复序列包含SEQ ID No.13
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17任一所示的序列。6.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。7.一种CRISPR
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Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1所述的Cas蛋白以及至少一种权利要求4所述的gRNA。8.一种载体系统，其特征在于，所述载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：a)第一调控元件，该第一调控元件可操作地与权利要求4所述的gRNA连接，b)第二调控元件，该第二调控元件可操作地与权利要求1所述的Cas蛋白连接；其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其选自：权利要求4所述的gRNA，或编码权利要求4所述的gRNA的核酸，或权利要求4所述的gRNA的前体RNA，或编码权利要求4所述的gRNA的前体RNA核酸；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。10.一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其选自：权利要求4所述的gRNA，或编码权利要求4所述的gRNA的核酸，或权利要求4所述的gRNA的前体RNA，或编码权利要求4所述的gRNA的前体RNA核酸；(iii)结合在权利要求4所述的gRNA上的靶序列。11.一种工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所述的CRISPR
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Cas系统，或权利要求8所述的载体系统，或权利要求9所述的组合物，或权利要求10所述的活化的CRISPR复合物。12.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核
苷酸，或权利要求6所述的载体，或权利要求7所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，赵庆芝，刘锐恒，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：