一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，提供了一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用。所述IscB突变蛋白与亲本IscB蛋白相比，显著的提高了编辑活性，具有广泛的应用前景。利用本发明专利技术可以为实现更加高效的编辑工具和在体转导体系奠定基础，构建罕见病动物模型，推进罕见病致病机制的研究和治疗方案的探索，进一步推动基因编辑技术在临床治疗方面的应用。动基因编辑技术在临床治疗方面的应用。动基因编辑技术在临床治疗方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于基因编辑
，具体而言，本专利技术涉及一种IS200/IS60S转座子ISCB突变蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]作为广泛使用的基因组编辑工具，SpCas9和Cas12a能够在多种细胞种类和生物中起作用。它们可以用于全基因组筛选来研究基础生物功能，或者发现和验证复杂遗传病的潜在药物靶点。在临床试验中，Cas核酸酶经过递送可以治疗由已知遗传因素导致的疾病，例如在杜氏肌营养不良症(DMD)中，使用基因编辑可以修正基因突变或者诱发转录过程跳过有缺陷的外显子。
[0004]而AAV是一种在体内表达目标基因的有效和安全的载体，已广泛用于基因治疗，它的容量大概是4.7kb。传统的SpCas9、Cas12a等核酸酶虽然活性高具有良好的编辑功能，但它们的分子尺寸相比之下都过大。举例来说，广泛使用的SpCas9蛋白由1000
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1400个氨基酸组成，无法进行AAV包装，必须通过内含肽进行拆分，而如果利用两个AAV进行递送，导致SpCas9活性下降；相关的病毒滴度及后续可能多次注射可能会使机体产生抗体等问题的出现。这就限制了这些系统在基因治疗等领域的应用。
[0005]2021年，Science杂志刊登公开了一种由IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)。从蛋白结构预测分析中，IscB同样存在RuvC和HNH两个结构域。通过体外DNA切割实验，研究者发现IscB具备由ωRNA引导识别并切割特定DNA双链序列的能力，其PAM序列也被作者称为TAM(target
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adjacent motif)。
[0006]IscB已经具备了很多SpCas9的优点，比如有两个酶活性位点，分别负责一条DNA单链的切割；又比如ωRNA的结构较为复杂，便于进行改造。而IscB相比SpCas9最大的优势在于其非常小的体积，仅由500个左右的氨基酸组成，为递送提供了极大的便利，同时也就腾出了巨大的改造空间。
[0007]但是IscB蛋白在真核细胞中整体编辑效率较低，本申请对IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)进行了优化，实现更高效的编辑，为递送提供更多选择，进一步拓宽了基因编辑技术在临床治疗方面的应用。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了一种IscB突变蛋白及其应用。本专利技术经过大量实验和反复摸索，通过一种基于可突变位点的算法对IscB蛋白进行位点预测突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。
[0009]本专利技术中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸
NLS。
[0026]在具体的实施方案中，本专利技术保护一种核酸分子，其编码前文所述的融合蛋白。
[0027]第三方面，本专利技术保护一种组合物，所述组合物包括：
[0028]1)第一核酸，其为编码上述蛋白的核酸分子；和
[0029]2)第二核酸，其为导向RNA，即本专利技术中所述的omigaRNA(obligate mobile element
–
guided activity RNA)，所述omigaRNA根据靶基因序列设计构建。
[0030]在具体的实施方案中，所述组合物包括IscB mRNA和omigaRNA；所述IscB mRNA为SEQ ID NO.1的转录本；SEQ ID NO.5在SEQ ID NO.2的基础上增加了C端一侧的1xMyc NLS序列。
[0031]第四方面，本专利技术还提供了一种由IS200/IS605转座子家族编码的RNA引导的核酸酶(IscB)系统，其特征在于，所述系统包括：
[0032](1)蛋白组分，其选自：前文所述的IscB突变蛋白、前文所述IscB突变蛋白的衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意组合；
[0033](2)核酸组分，其为omigaRNA，所述omigaRNA能够结合(i)所述蛋白组分，并引导蛋白组分至目标基因靶序列的gRNA核酸序列；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成组合物。
[0034]第五方面，本专利技术还保护前文任一所述的突变蛋白，或前文任一所述的融合蛋白，或前文所述的核酸分子，或前文所述的系统，在基因编辑中的应用，所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
[0035]在具体的实施方案中，所述基因编辑为基因敲除或基因敲入。
[0036]第六方面，本专利技术保护前文任一所述的突变蛋白，或前文任一所述的融合蛋白，或前文所述的核酸分子，或前文所述的系统，在制备制剂中的用途，所述制剂用于：
[0037](i)基因或基因组编辑；
[0038](ii)靶核酸检测和/或诊断；
[0039](iii)编辑靶基因座中的靶序列来修饰生物；
[0040](iv)疾病的治疗；
[0041](v)靶向靶基因；
[0042](vi)切割目的基因。
[0043]本专利技术的有益效果在于：
[0044](1)本专利技术可以在多个内源性位点进行高效的基因敲除及基因敲入。
[0045](2)本专利技术的IscB系统结构很小，便于AAV的递送，为解决包装体积限制提供思路，增加在基因治疗领域的应用可能。
[0046](3)IscB具有两个活性切割结构域，基于本专利技术优化的IscB蛋白的基础上可以做nickase单链编辑。
[0047](4)本专利技术可以用来构建基因突变致病动物模型，针对罕见病突变位点进行敲除。
附图说明
[0048]图1.为亲本蛋白核定位信号的更换。其中，A为核定位信号更换的3种不同方法，B为在细胞内两处内源性位点上编辑效率的验证。
[0049]图2.基于算法预测的IscB蛋白单突变位点及其在细胞内编辑效率的验证。其中，A为IscB蛋白的单突变位点的标注，B为IscB蛋白单突变位点在细胞内编辑效率的验证。
[0050]图3.IscB蛋白高效单突变位点的组合突变在在细胞内编辑效率的验证。
[0051]图4.最优IscB蛋白的两种突变体在293T细胞中的不同内源性位点上的编辑效率验证。
[0052]图5.IscB蛋白复合物在小鼠Angptl3内源性基因上的模式图。
[0053]图6.最优IscB蛋白的两种突变体在小鼠Angptl3内源性基因上的编辑效率验证。
具体实施方式
[0054]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0055]除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。
[0056]另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白与如SEQ ID NO:1所示的野生型IscB蛋白相比，在以下任一个或多个氨基酸位点处存在突变：第17位、第21位、第25位、第34位、第40位、第51位、第107位、第122位、第135位、第140位、第150位、第152位、第153位、第154位、第160位、第161位、第197位、第198位、第300位、第301位、第376位、第377位、第383位、第401位、第402位、第403位、第418位、第422位、第432位、第456位、第459位、第460位、第468位、第485位，且所述突变均突变为精氨酸。2.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，编码野生型IscB蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白为将野生型IscB蛋白的第401位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质；优选的，编码所述突变蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白为将野生型IscB蛋白的第376位氨基酸突变为精氨酸，且将第456位氨基酸突变为精氨酸得到的蛋白质；优选的，编码所述突变蛋白的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1
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4任一所述的突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：张军，顾秋茜，毛聪，孟茹，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：