新型OMNI-50CRISPR核酸酶-RNA复合物制造技术

一种包含非天然存在的RNA分子的组合物，所述RNA分子包含RNA支架部分，所述RNA支架部分具有以下结构：crRNA重复序列部分

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型OMNI
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50 CRISPR核酸酶
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RNA复合物
[0001]本申请要求于2020年11月4日提交的美国临时申请第63/109,835号的权益，其内容在此引入作为参考。
[0002]在整个本申请中，参考了各种出版物，包括括号中参考的出版物。本申请中所提及的所有出版物的公开内容在此以引用的方式整体并入本申请中，以便提供对本专利技术所涉及的技术和可以与本专利技术一起采用的技术中的特征的附加描述。序列表引用
[0003]本申请通过引用并入了存在于名为“211103_91628
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A
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PCT_Sequence_Listing_AWG.txt”的文件中的核苷酸序列，其大小为88千字节，并且其在2021年10月25日以IBM
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PC机器格式创建，具有与MS
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Windows的操作系统兼容性，该文件含在作为本申请的一部分的2021年11月3日提交的文本文件中。


[0004]本专利技术尤其涉及用于基因组编辑的组合物和方法。

技术介绍

[0005]细菌和古细菌适应性免疫的成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)系统示出蛋白质组成和基因组基因座架构(genomic loci architecture)的极端多样性。CRISPR系统已经成为研究和基因组工程的重要工具。然而，CRISPR系统的许多细节尚未确定，并且CRISPR核酸酶的适用性可能受到序列特异性要求、表达或递送挑战的限制。不同的CRISPR核酸酶具有不同的特点，诸如：大小、PAM位点、中靶活性、特异性、切割模式(例如，平端(blunt)、交错末端)和切割后形成的突出的得失位(indel)模式。不同的特点集合可以用于不同的应用。例如，一些CRISPR核酸酶可能能够靶向其他CRISPR核酸酶由于PAM位点的限制而无法靶向的特定基因组基因座。另外，目前在使用中的一些CRISPR核酸酶展现预免疫性，这可能会限制体内适用性。参见Charlesworth等人，《自然医学(Nature Medicine)》(2019)和Wagner等人，《自然医学》(2019)。因此，新型CRISPR核酸酶和激活并且靶向它们的RNA分子的发现、工程化和改进是重要的。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了包含非天然存在的RNA分子的组合物，该RNA分子包含crRNA重复序列部分和引导序列部分，其中RNA分子在tracrRNA序列的存在下与OMNI
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50核酸酶形成复合物并且将该OMNI
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50核酸酶靶向到DNA靶位点，其中该tracrRNA序列由RNA分子的tracrRNA部分或第二RNA分子的tracrRNA部分编码。
[0007]本专利技术还提供了包含非天然存在的RNA分子的组合物，该RNA分子包含crRNA重复序列部分、引导序列部分和tracrRNA部分，其中RNA分子与OMNI
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50核酸酶形成复合物并且将该OMNI
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50核酸酶靶向到与RNA分子的引导序列部分具有互补性的DNA靶位点。
[0008]本专利技术还提供了包含非天然存在的RNA分子的组合物，该RNA分子包含RNA支架部分，该RNA支架部分具有以下结构：crRNA重复序列部分
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接头部分
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tracrRNA部分；其中该RNA支架部分与OMNI
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50 CRISPR核酸酶形成复合物并且将该OMNI
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50CRISPR核酸酶靶向到与RNA分子的引导序列部分互补的DNA靶位点。
[0009]本文公开了可以用于基因组工程化、表观基因组工程化、基因组打靶、细胞的基因组编辑和/或体外诊断的组合物和方法，该组合物和方法使用OMNI
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50 CRISPR核酸酶和非天然存在的RNA分子，该非天然存在的RNA分子包含能够特异性结合并且激活OMNI
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50 CRISPR核酸酶的支架部分，以基于RNA分子的引导序列部分(也称为RNA间隔区部分)，靶向DNA靶位点。
[0010]所公开的组合物可以用于修饰基因组DNA序列。如本文所用，基因组DNA是指存在于一个或多个目的细胞中的线性和/或染色体DNA和/或质粒或其他染色体外DNA序列。在一些实施方案中，目的细胞为真核细胞。在一些实施方案中，目的细胞为原核细胞。在一些实施方案中，该方法在基因组DNA序列中的预先确定靶位点处产生双链断裂(DSB)，引起基因组中靶位点处DNA序列的突变、插入和/或缺失。
附图说明
[0011]图1A至图1G：表3中列出的3'修剪的sgRNA的预测二级结构。图1A：“全c”RNA结构。图1B：“短1”RNA结构。图1C：“短2”RNA结构。图1D：“短3”RNA结构。图1E：“短4”RNA结构。图1F：“短5”RNA结构。图1G：“短6”RNA结构。
[0012]图2：RNP中3'修剪的引导物(表3)的活性测定。纯化的OMNI
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50与IVT转录的短引导物反应。对于体外测定，RNP与5'
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FAM标记的线性底物反应。通过将切割片段的荧光除以切割片段和未切割片段的总和来计算切割效率。对于体内测定，用RNP电穿孔U2OS细胞，并且通过二代测序(NGS)以得失位频率确定活性。
[0013]图3A至图3M：表4中列出的完整支架(full scaffold)sgRNA版本f和版本c以及表5中列出的高级别的(high ranked)短sgRNA的预测二级结构。图3A：“全f”RNA结构。图3B：“全c”RNA结构。图3C：“NGS13”RNA结构。图3D：“NGS14”RNA结构。图3E：“NGS15”RNA结构。图3F：“NGS16”RNA结构。图3G：“NGS17”RNA结构。图3H：“NGS18”RNA结构。图3I：“NGS40”RNA结构。图3J：“NGS41”RNA结构。图3K：“NGS42”RNA结构。图3L：“NGS43”RNA结构。图3M：“NGS44”RNA结构。
[0014]图4A至图4F：表6中列出的中级别(medium ranked)的短sgRNA的预测二级结构。图4A：“NGS9”RNA结构。图4B：“NGS2”RNA结构。图4C：“NGS3”RNA结构。图4D：“NGS12”RNA结构。图4E：“NGS1”RNA结构。图4F：“NGS6”RNA结构。
[0015]图5A至图5E：在具有许可性引导物(permissive guides)(g35、g62)的U2OS哺乳动物细胞系中的RNP活性。用OMNI
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50的RNP与所示的sgRNA的对U2OS细胞进行电穿孔，并且通过NGS将活性确定为靶向的原型间隔区(protospacer)及其已知的脱靶上的得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含非天然存在的RNA分子的组合物，所述RNA分子包含crRNA重复序列部分和引导序列部分，其中所述RNA分子在tracrRNA序列的存在下与OMNI
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50核酸酶形成复合物并且将所述OMNI
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50核酸酶靶向到DNA靶位点，其中所述tracrRNA序列由所述RNA分子的tracrRNA部分或第二RNA分子的tracrRNA部分编码。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述crRNA重复序列部分的长度小于17个核苷酸，优选长度为12至16个核苷酸，或者其中所述crRNA重复序列部分的长度为17个或更多个核苷酸，优选长度为18至24个核苷酸。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述crRNA重复序列部分与由秘鲁江崎氏菌菌株M6.X2编码的成熟OMNI
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50crRNA重复序列具有至少60％至70％、71％至80％、81％至90％、91％至95％或96％至99％的序列同一性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述crRNA重复序列部分与SEQ ID NO:23具有至少60％至70％、71％至80％、81％至90％、91％至95％或96％至99％的序列同一性。5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述crRNA重复序列部分与SEQ ID NO:8、23、24和25中的任一个具有至少95％的序列同一性。6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述crRNA重复序列不同于SEQ ID NO:8或23。7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中包含所述crRNA重复序列部分和所述引导序列部分的所述RNA分子进一步包含所述tracrRNA部分。8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述crRNA重复序列部分通过多核苷酸接头部分与所述tracrRNA部分共价连接。9.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含包含所述tracrRNA部分的第二RNA分子。10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述OMNI
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50核酸酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述引导序列部分的长度为17至30个核苷酸，优选长度为22个核苷酸。12.一种包含非天然存在的RNA分子的组合物，所述RNA分子包含tracrRNA部分，其中所述RNA分子在crRNA重复序列部分和引导序列部分的存在下与OMNI
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50核酸酶形成复合物并且将所述OMNI
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50核酸酶靶向到DNA靶位点，其中所述crRNA重复序列部分和所述引导序列部分由所述RNA分子或第二RNA分子编码。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述tracrRNA部分的长度小于91个核苷酸，优选长度为90至80、89至80、79至70、69至60、59至50、49至40或39至28个核苷酸，或者其中所述tracrRNA部分的长度为91个或更多个核苷酸，优选长度为91至112个核苷酸。14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中所述tracrRNA部分与由秘鲁江崎氏菌菌株M6.X2编码的成熟OMNI
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50tracrRNA序列具有至少30％至40％、41％至50％、51％至60％、61％至70％、71％至80％、81％至90％、91％至95％或96％至99％的序列同一性。15.根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分与SEQ ID NO:5的所述tracrRNA部分具有至少30％至40％、41％至50％、51％至60％、61％至70％、
71％至80％、81％至90％、91％至95％或96％至99％的序列同一性。16.根据权利要求12至15中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分与SEQ ID NO:4、5、16至21、29至31、74至126、132至137和148至167中的任一个的所述tracrRNA部分具有至少95％的序列同一性。17.根据权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分不同于SEQ ID NO:4或5的tracr部分。18.根据权利要求12至17中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分包含长度小于19个核苷酸，优选长度为14至18个核苷酸的tracrRNA反重复序列部分。19.根据权利要求12至18中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分包含与SEQ ID NO:26具有至少60％至70％、71％至80％、81％至90％、91％至95％或96％至99％的序列同一性的tracrRNA反重复序列部分。20.根据权利要求12至19中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分包含与SEQ ID NO:9、26至28和138中的任一个具有至少95％的序列同一性的tracrRNA反重复序列部分。21.根据权利要求12至20中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分包含不同于SEQ ID NO:9或26的tracrRNA反重复序列部分。22.根据权利要求12至21中任一项所述的组合物，其中所述RNA分子包含tracrRNA部分，并且进一步包含crRNA重复序列部分和引导序列部分。23.根据权利要求12至22中任一项所述的组合物，其中所述tracrRNA部分通过多核苷酸接头部分与所述crRNA重复序列共价连接。24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述多核苷酸接头部分的长度为4至10个核苷酸。25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述多核苷酸接头具有GAAA序列。26.根据权利要求12至21中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二RNA分子，所述第二RNA分子包含crRNA重复序列部分和引导序列部分。27.根据权利要求12至26中任一项所述的组合物，其中所述OMNI
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50核酸酶与SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：利奥尔，
申请(专利权)人：埃门多生物公司，
类型：发明
国别省市：