具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白及其应用，所述PfAgo突变体蛋白相对于SEQ ID NO.1所示序列，具有第617位和/或618位的氨基酸突变，具体为：K617E/G和/或L618Y/F/W/G。相对于野生型PfAgo蛋白，本发明专利技术提供的PfAgo突变体蛋白在30～95℃的温度范围均有活性，有效扩展了pAgo蛋白的使用范围。有效扩展了pAgo蛋白的使用范围。有效扩展了pAgo蛋白的使用范围。

【技术实现步骤摘要】
具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白及其应用


[0001]本专利技术属于可编程核酸酶
，具体涉及具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]Argonaute(Ago)蛋白是一类新型的可编程核酸酶，它广泛分布于真核生物、真细菌和古生菌中。大部分真核Ago(eAgo)蛋白被发现使用5
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端磷酸化的向导RNA(5
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gRNA)去识别靶RNA，它在真核生物的RNA干扰途径中发挥重要作用。大部分原核Ago(pAgo)蛋白使用5
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端磷酸化的向导DNA(5
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gDNA)去识别靶DNA。原核生物体内缺乏RNA干扰途径，尽管近年来的研究表明pAgo蛋白可以在宿主中防御侵袭性遗传元件，并参与各种细胞内的活动，但目前pAgo蛋白的生理功能还不是特别清晰。CRISPR相关蛋白作为一种可编程的核酸酶，已经被报道可应用于不同的领域中。和CRISPR相关蛋白类似，Ago蛋白作为一种新型的可编程核酸酶已经被报道可应用于分子克隆、分子诊断、细胞内RNA和基因组编辑、活体成像等。与CRISPR
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Cas系统需要在靶标上有特定的基序且只能以RNA为向导链相比，pAgo蛋白在任意靶标序列上都表现出精确的内切酶活性，并且可以同时使用RNA和DNA作为向导核酸，因此在细胞内RNA和基因组编辑等应用方面具有巨大潜力。
[0003]PfAgo是一种来源于极端嗜热菌Pyrococcusfuriosus的pAgo蛋白，它能够在5
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gDNA的引导下对靶DNA进行切割，其在87～99.99℃的温度范围内活性最高，同时其在37℃下短时间内无法切割靶DNA。PfAgo在高温下具有5
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gDNA介导的高DNA靶切割活性，这使其已经应用于分子克隆和分子诊断当中，但其在37℃下几乎没有活性，这限制了其应用于细胞内RNA和基因组编辑的可能性。而且，具有热稳定性并在低温下有催化活性的酶不仅易于保存，其应用范围也更加广泛。
[0004]生物对环境生态位的适应是进化的标志。一个普遍的例子是热适应，其中两个后代在不同的极端温度下进化。这些生物体之间生理差异的基础是催化必要反应的酶的变化，来自每个生物体的同源物经历适应性突变，在各自的生理温度下保持相似的催化速率。然而，导致这些适应性差异的序列变化通常发生在远离底物结合位点的表面暴露位点，使酶的活性位点在结构上不受干扰。这些变化是如何变构传播到活性部位，以调节活性，尚不清楚。2018年，Harry G.Saavedra等人提出动态变构可以促进酶的冷适应，在保留基态结构的同时，选择可变构的位点进行突变以提高局部展开的概率。2019年，Satoshi Akanuma等人展示了一种有效的方法去探索氨基酸替代以增强嗜热酶的低温催化活性，该方法基于一组嗜热/中温酶的序列比对。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术旨在对PfAgo蛋白进行基于结构的突变体筛选以发掘在中温条件下有较好活性的PfAgo突变体蛋白，不仅可以为细胞内RNA靶向和基因编辑及其他应用做铺垫，扩大pAgo蛋白的使用范围，还能提供一种改造高温Ago蛋白的策略。
[0006]本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术的目的之一在于提供具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白，这些突变体蛋白相对于野生型PfAgo蛋白，在结构上距离活性位点和结合底物以外以内的氨基酸发生了突变，使得催化活性温度改变。本专利技术所述活性位点具体指野生型PfAgo蛋白的DEDH催化四联体。
[0008]具体的，本专利技术提供的PfAgo突变体蛋白的突变位点为SEQ ID NO.1所示序列(野生型PfAgo蛋白的氨基酸序列)的第617位和/或第618位；在SEQ ID NO.1所示序列中，第617位的氨基酸为赖氨酸(Lys，K)，第617位的氨基酸为亮氨酸(Leu，L)。
[0009]在本专利技术提供的PfAgo突变体蛋白中，第617位的赖氨酸突变为除赖氨酸以外的其他任意一种氨基酸，第618位的亮氨酸突变为除亮氨酸以外的其他任意一种氨基酸。
[0010]相对于野生型PfAgo蛋白，本专利技术提供的PfAgo突变体蛋白在30～95℃均具有靶核酸切割活性，扩大了PfAgo蛋白的适用范围，使其具有了应用于细胞内RNA和基因组编辑的潜力。
[0011]优选地，在本专利技术提供的PfAgo突变体蛋白中，第617位的赖氨酸突变为谷氨酸(Glu，E)或甘氨酸(Gly，G)，记为K617E/G；第618位的亮氨酸突变为酪氨酸(Tyr，Y)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)或甘氨酸，记为L618Y/F/W/G。
[0012]本专利技术实施例数据表明：
[0013](a1)当第617位赖氨酸突变为谷氨酸或甘氨酸后，所得的两个突变体蛋白能够在向导DNA的引导下切割靶DNA，其中，第617位赖氨酸突变为甘氨酸后所得的突变体蛋白在37℃下的活性更优；
[0014](a2)当第618位亮氨酸分别突变为酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甘氨酸后，所得的四个突变体能够在向导DNA的引导下切割靶DNA；其中，第618位亮氨酸突变为酪氨酸或甘氨酸后，所得的突变体蛋白在37℃下的活性更优，且还能在向导DNA的引导下切割靶RNA；第618位亮氨酸突变为甘氨酸后所得的突变体蛋白还能在5
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gRNA的引导下切割靶RNA；
[0015](a3)当第617位和第618位同时突变时，具体分别突变成甘氨酸和酪氨酸(即K617E和L618Y)，或同时突变为甘氨酸(即K617G和L618G)，所得的两个突变体蛋白在37℃的活性进一步提高，能够在向导DNA的引导下切割靶DNA和RNA；其中，第617位和第618位同时突变为甘氨酸所得的突变体蛋白(记为PfAgo_K617G/L618G)在37℃下的活性最佳，且还能在5
’
P
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gRNA的引导下切割靶RNA。
[0016]本专利技术的目的之二在于提供一些与上述PfAgo突变体蛋白相关的生物材料，包括：
[0017](b1)编码PfAgo突变体蛋白的核酸分子；
[0018](b2)包含(b1)所述核酸分子的表达盒或载体；
[0019](b3)包含(b2)所述载体的转化体。
[0020]对于(b1)所述的核酸分子，本专利技术一实施例提供了如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，该序列编码的PfAgo突变体蛋白(即PfAgo_K617G/L618G)是将第617位赖氨酸、第618位亮氨酸同时突变为甘氨酸，且该突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0021]对于(b2)所述的载体，可以为pET质粒，如本专利技术一实施例将编码PfAgo突变体蛋白的核酸片段连接至pET本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有中温靶核酸切割活性的PfAgo突变体蛋白，其特征在于，所述PfAgo突变体蛋白相对于SEQ ID NO.1所示序列，具有第617位和/或618位的氨基酸突变，具体为：将第617位赖氨酸突变为其他氨基酸，和/或将第618位亮氨酸突变为其他氨基酸。2.根据权利要求1所述的PfAgo突变体蛋白，其特征在于，所述PfAgo突变体蛋白的氨基酸突变选自：K617E/G；或L618Y/F/W/G。3.编码权利要求1或2所述PfAgo突变体蛋白的核酸分子。4.包含权利要求3所述核酸分子的表达盒、载体或转化体。5.一种核酸切割体系，其特征在于，所述核酸切割体系包括：单链向导核酸；权利要求1所述的PfAgo突变体蛋白。6.根据权利要求5所述的核酸切割体系，其特征在于，所述单链向导核酸的长度为12～30nt，所述单链向导核酸为5
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gRNA、5
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P
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gDNA或5
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【专利技术属性】
技术研发人员：马立新，王珑瑜，王飞，谢晓晨，陈晚苹，黄福勇，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：