DNA修饰酶及其活性片段及变体与使用方法技术

提供了包括用于核酸的靶向编辑的新型脱氨酶多肽的组合物及方法。组合物包括脱氨酶多肽。还提供了包括DNA结合多肽及本发明专利技术的脱氨酶的融合蛋白。融合蛋白包括与脱氨酶融合的RNA引导的核酸酶，任选地与引导RNA复合。组合物还包括编码脱氨酶或融合蛋白的核酸分子。还提供了包括编码脱氨酶或融合蛋白的核酸分子的载体及宿主细胞。的载体及宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA修饰酶及其活性片段及变体与使用方法
【相关申请的交叉引用】
[0001]本申请要求2020年9月11日提交的第63/077,089号美国临时申请及2021年2月8日提交的第63/146,840号美国临时申请的优先权，上述每一个专利申请都通过引用整体地并入本文。【关于序列表的声明】
[0002]与本申请关联的序列表已通过ASCII格式代替纸质副本来提供，并通过引用并入本说明书。该ASCII副本被命名为L103438_1230WO_0108_1_SL.txt，其大小为1,071,246字节，其创建于2021年9月9日，且以电子方式经由EFS
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Web提交。


[0003]本专利技术涉及分子生物学及基因编辑领域。

技术介绍

[0004]靶向基因组编辑或修饰正迅速成为基础及应用研究的重要工具。最初的方法涉及例如大范围核酸酶(meganuclease)、锌指融合蛋白或TALEN之类的工程核酸酶，这需要产生具有对每一种特定目标序列特异的工程化、可程序化、序列特异的DNA结合域的嵌合核酸酶。RNA引导的核酸酶(RGN)(例如，成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)(CRISPR)
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关联(Cas)的CRISPR
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Cas细菌系统的蛋白)通过将核酸酶与引导RNA(引导RNA与特定目标序列特异性杂交)复合而允许特定序列(specific sequence)的靶向。相较于为每一个目标序列产生嵌合核酸酶，生成目标特异性引导RNA的成本更低且更有效。这种RNA引导的核酸酶可用于通过序列特异性的双链断裂的引入来编辑基因组，该断裂经由易错的非同源末端连接(NHEJ)被修复，以在特定基因组位置(specific genomic location)引入突变。
[0005]另外，RGN可用于靶向DNA编辑措施。允许特异性修饰引入基因组DNA的核酸序列的靶向编辑，例如，靶向切割使得非常细微差异的措施能够研究基因功能和基因表达。RGN也可被用于产生嵌合蛋白，嵌合蛋白使用与例如脱氨酶之类的DNA修饰酶组合的RGN的RNA引导的活性，用于靶向碱基编辑。靶向编辑可被部署，用于靶向人的基因疾病或用于引入农作物基因组中农艺学上有益的突变。基因组编辑工具的发展为基于基因编辑的哺乳动物治疗及农业生物技术提供新措施。

技术实现思路

[0006]提供了用于修饰目标DNA分子的组合物及方法。组合物可用于修饰所关注的目标DNA分子。所提供的组合物包括脱氨酶多肽。还提供了包括核酸分子结合多肽(比如，DNA结合多肽)和脱氨酶多肽的融合蛋白以及包括包含RNA引导的核酸酶和脱氨酶多肽的融合蛋白及核糖核酸的核糖核蛋白复合物。所提供的组合物还包括编码脱氨酶多肽或融合蛋白的核酸分子以及包括核酸分子的载体及宿主细胞。本文所公开的方法被策划用于结合所关注
的目标DNA分子内的所关注的目标序列及修饰所关注的目标DNA分子。【专利技术详述】
[0007]受益于前述描述中呈现的教导，本专利技术所属领域普通技术人员将想到本文中阐述的本专利技术的许多修改及其他实施方案。因此，应该明白，本专利技术不限于所公开的具体实施方案，且修改及其他实施方案预期被包含在所附权利要求的范围内。虽然本文采用特定术语，但这类术语仅以一般性及描述性意义使用，而非出于限制性目的。I.概述
[0008]本公开内容提供了新型的腺嘌呤脱氨酶及包括核酸分子结合多肽(诸如，DNA结合多肽)及新型脱氨酶多肽的融合蛋白。在某些实施方案中，DNA结合多肽为序列特异性DNA结合多肽，因为DNA结合多肽以比与随机化背景序列的结合频率高的频率与目标序列结合。在一些实施方案中，DNA结合多肽为或衍生自大范围核酸酶(meganuclease)、锌指融合蛋白或TALEN。在一些实施方案中，融合蛋白包括RNA引导的DNA结合多肽和脱氨酶多肽。在一些实施方案中，RNA引导的DNA结合多肽为RNA引导的核酸酶，诸如，与引导RNA(也称为gRNA)结合的Cas9多肽域，而引导RNA转而经由链杂交结合目标核酸序列。
[0009]本文公开的脱氨酶多肽可将例如诸如腺嘌呤的核碱基脱氨基。脱氨酶将核碱基脱氨基可在相应残基处导致点突变，在本文中被称为“核酸编辑”或“碱基编辑”。由此，包括RNA引导的核酸酶(RGN)多肽和脱氨酶的融合蛋白可用于核酸序列的靶向编辑。
[0010]这样的融合蛋白可用于DNA的体外靶向编辑，比如，可用于基因修饰细胞的产生。这类基因修饰细胞可为植物细胞或动物细胞。这样的融合蛋白也可以可用于靶向突变的引入，比如，可用于在比如从受试者获得的、随后被重新引入同一或另一个受试者的细胞中离体地校正哺乳动物细胞中的基因缺陷；以及可用于靶向突变的引入，比如，基因缺陷的校正或哺乳动物受试者中的疾病关联基因中的去活化突变的引入。这样的融合蛋白也可以可用于植物细胞中的靶向突变的引入，比如，可用于有益的或农艺学上有价值的性状或等位基因的引入。
[0011]术语“蛋白质”、“肽”及“多肽”在本文中可被互换地使用，且指通过肽(酰胺)键被连接在一起的氨基酸残基的聚合物。该术语指任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常情况下，蛋白质、肽或多肽将为至少三个氨基酸的长度。蛋白质、肽或多肽可指个别蛋白质或蛋白质的集合。例如，通过添加诸如碳水化合物基团、羟基基团、磷酸盐基团、法呢基(farnesyl)基团、异法呢基基团、脂肪酸基团、用于共轭、官能化、或其他修饰等等的接头的化学实体，蛋白质、肽或多肽中的一个或更多个氨基酸可被修饰。蛋白质、肽或多肽也可为单一分子，或可为多分子复合物。蛋白质、肽或多肽可以就是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可为天然存在的、重组体、合成物、或其任意组合。
[0012]本文中提供的任何蛋白质可通过本领域中已知的任何方法生成。例如，本文提供的任何蛋白质可经由重组体蛋白质表达及纯化生成，这特别适合于包括肽接头的融合蛋白。重组体蛋白质表达及纯化的方法是熟知的，且包括Green及Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(4th ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,N.Y.(2012))描述的那些内容，其全部内容通过引用并入本文。II.脱氨酶
[0013]术语“脱氨酶”指催化脱氨基反应的酶。本专利技术的脱氨酶为核碱基脱氨酶，术语“脱
氨酶”及“核碱基脱氨酶”在本文中被可互换地使用。脱氨酶可为天然存在的脱氨酶酶或其活性片段或变体。脱氨酶可在诸如ssDNA或ssRNA的单链核酸上或诸如dsDNA或dsRNA的双链核酸上有活性。在一些实施方案中，脱氨酶只能对ssDNA脱氨基，而对dsDNA没有作用。
[0014]当前公开的方法及组合物包括腺嘌呤脱氨酶。在一些实施方案中，脱氨酶为ADAT家族本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的多肽，包括与SEQ ID NO:407、399、405、1
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10、400
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404、406和408
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441中任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脱氨酶活性。2.一种核酸分子，包括编码脱氨酶多肽的多核苷酸，其中该脱氨酶通过核苷酸序列编码，该核苷酸序列：(a)与SEQ ID NO:451、449、443、11
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20、444
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448、450和452
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485中任一项具有至少80％序列同一性，或(b)编码与SEQ ID NO:407、399、405、1
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10、400
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404、406和408
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441中任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。3.权利要求2所述的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包括可操作地连接至所述多核苷酸的异源启动子。4.一种药物组合物，包括药学上可接受的承载体和权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的核酸分子。5.一种融合蛋白，包括DNA结合多肽和与SEQ ID NO:407、399、405、1
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404、406和408
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441中任一项具有至少90％序列同一性的脱氨酶。6.权利要求5所述的融合蛋白，其中该脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶。7.权利要求5或6所述的融合蛋白，其中该DNA结合多肽为大范围核酸酶、锌指融合蛋白或TALEN。8.权利要求5或6所述的融合蛋白，其中该DNA结合多肽为RNA引导的DNA结合多肽。9.权利要求8所述的融合蛋白，其中该RNA引导的DNA结合多肽为RNA引导的核酸酶(RGN)多肽。10.权利要求9所述的融合蛋白，其中该RGN为II型CRISPR
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Cas多肽。11.权利要求9所述的融合蛋白，其中该RGN为V型CRISPR
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Cas多肽。12.权利要求9
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11中任一项所述的融合蛋白，其中该RGN为RGN切口酶。13.权利要求9所述的融合蛋白，其中该RGN具有与SEQ ID NO:41、60、366和368中任一项具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。14.权利要求12所述的融合蛋白，其中该RGN切口酶为SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项。15.权利要求5
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14中任一项所述的融合蛋白，其中该融合蛋白进一步包括至少一个核定位信号(NLS)。16.一种核酸分子，包括编码融合蛋白的多核苷酸，该融合蛋白包括DNA结合多肽和脱氨酶，其中该脱氨酶通过核苷酸序列编码，该核苷酸序列：(a)与SEQ ID NO:451、449、443、11
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20、444
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448、450和452
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485中任一项具有至少80％序列同一性，或(b)编码与SEQ ID NO:407、399、405、1
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10、400
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404、406和408
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441中任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。17.权利要求16所述的核酸分子，其中该脱氨酶为腺嘌呤脱氨酶。18.权利要求16或17所述的核酸分子，其中该DNA结合多肽为大范围核酸酶、锌指融合蛋白或TALEN。19.权利要求16或17所述的核酸分子，其中该DNA结合多肽为RNA引导的DNA结合多肽。
20.权利要求19所述的核酸分子，其中该RNA引导的DNA结合多肽为RNA引导的核酸酶(RGN)多肽。21.权利要求20所述的核酸分子，其中该RGN为II型CRISPR
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Cas多肽。22.权利要求20所述的核酸分子，其中该RGN为V型CRISPR
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Cas多肽。23.权利要求20所述的核酸分子，其中该RGN为RGN切口酶。24.权利要求20所述的核酸分子，其中该RGN具有与SEQ ID NO:41、60、366和368中任一项具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。25.权利要求23所述的核酸分子，其中该RGN切口酶为SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项。26.权利要求16
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25中任一项所述的核酸分子，其中编码该融合蛋白的多核苷酸在其5'末端处可操作地连接至异源启动子。27.权利要求16
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26中任一项所述的核酸分子，其中编码该融合蛋白的该多核苷酸在其3'末端处可操作地连接至异源终止子。28.权利要求16
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27中任一项所述的核酸分子，其中该融合蛋白包括一个或多个核定位信号。29.权利要求16
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28中任一项所述的核酸分子，其中该融合蛋白针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。30.权利要求16
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28中任一项所述的核酸分子，其中该融合蛋白针对在原核细胞中的表达而被密码子优化。31.一种包括权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子的载体。32.权利要求31所述的载体，进一步包括编码能够与目标序列杂交的引导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列。33.权利要求32所述的载体，其中该gRNA为单引导RNA。34.权利要求32所述的载体，其中该gRNA为双引导RNA。35.一种包括权利要求5
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15中任一项所述的融合蛋白、权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子、或权利要求31
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34中任一项所述的载体的细胞。36.一种包括权利要求5
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15中任一项所述的融合蛋白的细胞，其中该细胞进一步包括引导RNA。37.一种制备融合蛋白的方法，包括在表达该融合蛋白的条件下，培养权利要求35或36所述的细胞。38.一种制备融合蛋白的方法，包括将权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子或权利要求31
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34中任一项所述的载体引入细胞内，以及在表达该融合蛋白的条件下，培养该细胞。39.权利要求37或38所述的方法，进一步包括纯化所述融合蛋白。40.一种制备RGN融合核糖核蛋白复合物的方法，包括将权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子和包含编码引导RNA的表达盒的核酸分子、或权利要求31
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34中任一项所述的载体引入细胞内，以及在表达该融合蛋白和gRNA且形成RGN融合核糖核蛋白复合物的条件下，培养该细胞。41.权利要求40所述的方法，进一步包括纯化所述RGN融合核糖核蛋白复合物。
42.一种修饰包括目标DNA序列的目标DNA分子的系统，所述系统包括：a)包括RNA引导的核酸酶多肽(RGN)和脱氨酶的融合蛋白或编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中该脱氨酶具有与SEQ ID NO:407、399、405、1
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441中任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及b)能够与所述目标DNA序列杂交的一个或多个引导RNA，或编码该一个或多个引导RNA(gRNA)的一个或多个核苷酸序列；以及其中该一个或多个引导RNA能够与该融合蛋白形成复合物，以将所述融合蛋白导向至与所述目标DNA序列结合且修饰该目标DNA分子。43.权利要求42所述的系统，其中编码一个或多个引导RNA的所述核苷酸序列和编码融合蛋白的所述核苷酸序列中的至少一个可操作地连接至与所述核苷酸序列异源的启动子。44.权利要求42或43所述的系统，其中该目标DNA序列为真核目标DNA序列。45.权利要求42
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44中任一项所述的系统，其中该目标DNA序列与被该RGN识别的前间隔序列邻近基序(PAM)相邻地定位。46.权利要求42
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45中任一项所述的系统，其中该目标DNA分子在细胞内。47.权利要求42
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46中任一项所述的系统，其中该融合蛋白的该RGN为II型CRISPR
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Cas多肽。48.权利要求42
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46中任一项所述的系统，其中该融合蛋白的该RGN为V型CRISPR
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Cas多肽。49.权利要求42
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46中任一项所述的系统，其中该融合蛋白的该RGN具有与SEQ ID NO:41、60、366或368具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。50.权利要求42
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46中任一项所述的系统，其中该融合蛋白的该RGN为RGN切口酶。51.权利要求50所述的系统，其中该RGN切口酶为SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项。52.权利要求42
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51中任一项所述的系统，其中该融合蛋白包括一个或多个核定位信号。53.权利要求42
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52中任一项所述的系统，其中该融合蛋白针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。54.权利要求42
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53中任一项所述的系统，其中编码该一个或多个引导RNA的核苷酸序列和编码融合蛋白的核苷酸序列定位在一个载体上。55.一种药物组合物，包括药学上可接受的承载体和权利要求5
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15中任一项所述的融合蛋白、权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子、权利要求31
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34中任一项所述的载体、权利要求35或36所述的细胞、或权利要求42
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54中任一项所述的系统。56.一种用于修饰包括目标DNA序列的目标DNA分子的方法，所述方法包括将根据权利要求42
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54中任一项所述的系统递送至所述目标DNA分子或包括该目标DNA分子的细胞。57.一种用于修饰包括目标序列的目标DNA分子的方法，包括：a)通过组合以下来在体外将RGN脱氨酶核糖核苷酸复合物在适合形成该RGN脱氨酶核糖核苷酸复合物的条件下进行组装：i)能够与该目标DNA序列杂交的一个或多个引导RNA；以及ii)包括RNA引导的核酸酶多肽(RGN)和至少一个脱氨酶的融合蛋白，其中该脱氨酶具
有与SEQ ID NO:407、399、405、1
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441中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及b)使所述目标DNA分子或包括所述目标DNA分子的细胞与在体外组装的RGN脱氨酶核糖核苷酸复合物接触；其中该一个或多个引导RNA与该目标DNA序列杂交，从而将所述融合蛋白导向至与所述目标DNA序列结合，且发生该目标DNA分子的修饰。58.权利要求56或57所述的方法，其中所述经修饰的目标DNA分子包括该目标DNA分子内的至少一个核苷酸的A>N突变，其中N为C、G、或T。59.权利要求58所述的方法，其中所述经修饰的目标DNA分子包括该目标DNA分子内的至少一个核苷酸的A>G突变。60.权利要求56
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59中任一项所述的方法，其中该融合蛋白的该RGN为II型CRISPR
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Cas多肽。61.权利要求56
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59中任一项所述的方法，其中该融合蛋白的该RGN为V型CRISPR
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Cas多肽。62.权利要求56
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59中任一项所述的方法，其中该融合蛋白的该RGN具有与SEQ ID NO:41、60、366或368具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。63.权利要求56
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59中任一项所述的方法，其中该融合蛋白的该RGN为RGN切口酶。64.权利要求63所述的方法，其中该RGN切口酶为SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项。65.权利要求56
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64中任一项所述的方法，其中该融合蛋白包括一个或多个核定位信号。66.权利要求56
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65中任一项所述的方法，其中该融合蛋白针对在真核细胞中的表达而被密码子优化。67.权利要求56
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66中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列为真核目标DNA序列。68.权利要求56
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67中任一项所述的方法，其中所述目标DNA序列与前间隔序列邻近基序(PAM)相邻地定位。69.权利要求56
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68中任一项所述的方法，其中该目标DNA分子在细胞内。70.权利要求69所述的方法，进一步包括选择包括所述经修饰的DNA分子的细胞。71.一种包括权利要求70所述的方法的经修饰的目标DNA序列的细胞。72.一种药物组合物，包括权利要求71所述的细胞和药学上可接受的承载体。73.一种利用针对基因遗传性疾病的因果突变中的校正来生成经基因修饰的细胞的方法，该方法包括将以下引入该细胞内：a)包括RNA引导的核酸酶多肽(RGN)和脱氨酶的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸，其中该脱氨酶具有与SEQ ID NO：407、405、399、1
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404、406和408
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441中任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中编码该融合蛋白的所述多核苷酸可操作地连接至启动子，以使得该融合蛋白在该细胞中表达；以及b)能够与目标DNA序列杂交的一个或多个引导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的多核苷酸，其中编码gRNA的所述多核苷酸可操作地连接至启动子，以使得该gRNA在该细胞中表达；由此，该融合蛋白和gRNA靶向该因果突变的该基因组位置且修饰该基因组序列以除去
该因果突变。74.权利要求73所述的方法，其中该融合蛋白的所述RGN为RGN切口酶。75.权利要求74所述的方法，其中该RGN切口酶为SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项。76.权利要求73
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75中任一项所述的方法，其中该基因组修饰包括将至少一个核苷酸的A>G突变引入该目标DNA序列内。77.权利要求73
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76中任一项所述的方法，其中该因果突变的校正包括校正无义突变。78.权利要求73所述的方法，其中该基因遗传性疾病为表34中列出的疾病。79.权利要求73所述的方法，其中该基因遗传性疾病为囊性纤维化。80.一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求55或72所述的药物组合物。81.权利要求80所述的方法，其中所述疾病与因果突变关联，且所述药物组合物的所述有效量校正所述因果突变。82.权利要求5
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15中任一项所述的融合蛋白、权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子、权利要求31
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34中任一项所述的载体、权利要求35、36及71中任一项所述的细胞、或权利要求42
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54中任一项所述的系统用于治疗受试者的疾病的用途。83.权利要求82所述的用途，其中所述疾病与因果突变关联，且所述治疗包括校正所述因果突变。84.权利要求5
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15中任一项所述的融合蛋白、权利要求16
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30中任一项所述的核酸分子、权利要求31
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34中任一项所述的载体、权利要求35、36及71中任一项所述的细胞、或权利要求42
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54中任一项所述的系统在制备用于治疗疾病的药物中的用途。85.权利要求84所述的用途，其中所述疾病与因果突变关联，且有效量的所述药物校正所述因果突变。86.一种包括编码RNA引导的核酸酶(RGN)多肽的多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸包括编码RGN多肽的核苷酸序列，该RGN多肽包括与SEQ ID NO：41或60具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，但缺少SEQ ID NO：41或60的氨基酸残基590至597；其中当与能够与所述目标DNA序列杂交的引导RNA(gRNA)结合时，所述RGN多肽能够以RNA引导的序列特异性方式结合目标DNA序列。87.权利要求86所述的核酸分子，其中编码RGN多肽的所述多核苷酸可操作地连接至与所述多核苷酸异源的启动子。88.权利要求86或87所述的核酸分子，其中所述RGN多肽是无核酸酶活性的或起切口酶作用。89.权利要求86
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88中任一项所述的核酸分子，其中该RGN多肽可操作地融合至碱基编辑多肽。90.一种载体，包括权利要求86
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89中任一项所述的核酸分子。91.一种分离的多肽，包括与SEQ ID NO:41或60具有至少95％序列同一性的氨基酸序列，但缺少SEQ ID NO:41或60的氨基酸残基590至597，其中所述多肽为RNA引导的核酸酶。92.权利要求91所述的分离的多肽，其中所述RGN多肽包括与SEQ ID NO:366或368具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
93.权利要求91或92所述的分离的多肽，其中所述RGN多肽是无核酸酶活性的或起切口酶作用。94.权利要求91
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93中任一项所述的分离的多肽，其中该RGN多肽与碱基编辑多肽可操作地融合。95.一种包括权利要求86
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89中任一项所述的核酸分子、权利要求90所述的载体、或权利要求91
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94中任一项所述的多肽的细胞。96.一种分离的多肽，包括与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有脱氨酶活性。97.权利要求96所述的分离的多肽，其中该多肽包括SEQ ID NO:407所示的氨基酸序列。98.一种核酸分子，包括编码脱氨酶多肽的多核苷酸，其中该脱氨酶通过核苷酸序列编码，该核苷酸序列：a)与SEQ ID NO:451具有至少80％序列同一性，或b)编码与SEQ ID NO:407中任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。99.权利要求98所述的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包括可操作地连接至所述多核苷酸的异源启动子。100.一种药物组合物，包括药学上可接受的承载体和权利要求96
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97中任一项所述的多肽或权利要求98
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99中任一项所述的核酸分子。101.一种融合蛋白，包括DNA结合多肽和与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的脱氨酶。102.权利要求101所述的融合蛋白，其中该DNA结合多肽为RNA引导的核酸酶(RGN)多肽。103.权利要求102所述的融合蛋白，其中该RGN多肽为II型CRISPR
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Cas多肽或V型CRISPR
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Cas多肽。104.权利要求101
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103中任一项所述的融合蛋白，其中该RGN多肽为Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9
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NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9
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KKH、环状排列Cas9、Argonaute(Ago)、SmacCas9、Spy
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macCas9域、或具有SEQ ID NO:41、60、366或368中任一项所示氨基酸序列的RGN多肽。105.权利要求102
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104中任一项所述的融合蛋白，其中该RGN多肽为切口酶。106.权利要求105所述的融合蛋白，其中该切口酶具有与SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。107.一种核酸分子，包括编码包括DNA结合多肽和脱氨酶的融合蛋白的多核苷酸，其中该脱氨酶通过核苷酸序列编码，该核苷酸序列：a)与SEQ ID NO:451具有至少80％序列同一性，或b)编码与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。108.权利要求107所述的核酸分子，其中该DNA结合多肽为RGN多肽。109.权利要求108所述的核酸分子，其中该RGN为II型CRISPR
‑
Cas多肽或V型CRISPR
‑
Cas多肽。
110.权利要求107
‑
109中任一项所述的核酸分子，其中该RGN多肽为Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9
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NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9
‑
KKH、环状排列Cas9、Argonaute(Ago)、SmacCas9、Spy
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macCas9域、或具有SEQ ID NO:41、60、366或368中任一项所示的氨基酸序列的RGN多肽。111.权利要求108
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110中任一项所述的核酸分子，其中该RGN多肽为切口酶。112.权利要求111所述的核酸分子，其中该切口酶具有与SEQ ID NO:42、52
‑
59、61、397和398中任一项具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。113.一种包括权利要求107
‑
112中任一项所述的核酸分子的载体。114.权利要求113所述的载体，进一步包括编码能够与目标序列杂交的引导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列。115.一种核糖核蛋白(RNP)复合物，包括权利要求101
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106中任一项所述的融合蛋白和结合至该融合蛋白的该DNA结合多肽的引导RNA。116.一种包括权利要求101
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106中任一项所述的融合蛋白、权利要求107
‑
112中任一项所述的核酸分子、权利要求113
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114中任一项所述的载体、或权利要求115所述的RNP复合物的细胞。117.一种用于修饰包括目标DNA序列的目标DNA分子的系统，所述系统包括：a)包括RNA引导的核酸酶(RGN)多肽和脱氨酶的融合蛋白或编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中该脱氨酶具有与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及b)能够与所述目标DNA序列杂交的一个或多个引导RNA或编码该一个或多个引导RNA(gRNA)的一个或多个核苷酸序列；以及其中该一个或多个引导RNA能够与该融合蛋白形成复合物，以便将所述融合蛋白导向至与所述目标DNA序列结合且修饰该目标DNA分子。118.权利要求117所述的系统，其中编码一个或多个引导RNA的所述核苷酸序列和编码融合蛋白的所述核苷酸序列的中的至少一种可操作地连接至与所述核苷酸序列异源的启动子。119.权利要求117
‑
118中任一项所述的系统，其中该目标DNA序列与通过该RGN多肽识别的前间隔序列邻近基序(PAM)相邻地定位。120.权利要求117
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119中任一项所述的系统，其中该目标DNA序列包括选自SEQ ID NO:62
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97、116
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139、152
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185、203
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234、251
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286、305
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344、562和563的核酸序列或其互补体。121.权利要求117
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120中任一项所述的系统，其中该gRNA序列包括选自SEQ ID NO:98
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115、140
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151、186
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202、235
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250、287
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304、345
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364和564的核酸序列。122.权利要求117
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121中任一项所述的系统，其中该融合蛋白的该RGN多肽为II型CRISPR
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Cas多肽或V型CRISPR
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Cas多肽。123.权利要求117
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122中任一项所述的系统，其中该RGN多肽为Cas9、CasX、CasY、Cpfl、C2cl、C2c2、C2c3、GeoCas9、CjCas9、Casl2a、Casl2b、Casl2g、Casl2h、Casl2i、Casl3b、Casl3c、Casl3d、Casl4、Csn2、xCas9、SpCas9
‑
NG、LbCasl2a、AsCasl2a、Cas9
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KKH、环状排列Cas9、Argonaute(Ago)、SmacCas9、Spy
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macCas9域、或具有SEQ ID NO:41、60、366或368中任一项所示氨基酸序列的RGN。
124.权利要求123所述的系统，其中该RGN多肽为切口酶。125.权利要求124所述的系统，其中该切口酶具有与SEQ ID NO:42、52
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59、61、397和398中任一项具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。126.一种药物组合物，包括药学上可接受的承载体和权利要求101
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106中任一项所述的融合蛋白、权利要求1107
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112中任一项所述的核酸分子、权利要求113
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114中任一项所述的载体、权利要求115所述的RNP复合物、权利要求116所述的细胞、或权利要求117
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125中任一项所述的系统。127.一种用于修饰包括目标序列的目标DNA分子的方法，包括：a)通过组合以下来将RGN脱氨酶核糖核苷酸复合物在适合形成该RGN脱氨酶核糖核苷酸复合物的条件下进行组装：i)能够与目标DNA序列杂交的一个或多个引导RNA；以及ii)包括RNA引导的核酸酶多肽(RGN)和至少一个脱氨酶的融合蛋白，其中该脱氨酶具有与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；以及b)使所述目标DNA分子或包括所述目标DNA分子的细胞与组装的RGN脱氨酶核糖核苷酸复合物接触；其中该一个或多个引导RNA与该目标DNA序列杂交，从而将所述融...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：生命编辑制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：