尿嘧啶稳定蛋白及其活性片段和变体以及使用方法技术

提供了包含用于核酸的靶向编辑的尿嘧啶稳定多肽的组合物和方法。组合物包含尿嘧啶稳定多肽。还提供了融合蛋白，其包含i)DNA结合多肽；ii)脱氨酶；和iii)尿嘧啶稳定多肽(USP)。融合蛋白包含与脱氨酶融合并进一步与USP融合的RNA引导的核酸酶，其任选地与引导RNA形成复合物。组合物还包含编码USP或融合蛋白的核酸分子。还提供了包含编码USP或融合蛋白的核酸分子的载体和宿主细胞。子的载体和宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】尿嘧啶稳定蛋白及其活性片段和变体以及使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月15日提交的美国临时申请号63/052,175的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与本申请相关的序列表以ASCII格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书中。名为L103438_1220WO_0106_5_SL.txt的ASCII副本大小为658,586字节，创建于2021年7月14日，并通过EFS
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Web以电子方式提交。


[0005]本专利技术涉及分子生物学和基因编辑领域。

技术介绍

[0006]靶向基因组编辑或修饰正迅速成为基础及应用研究的重要工具。最初的方法涉及诸如大范围核酸酶(meganuclease)、锌指融合蛋白或TALEN之类的工程化核酸酶，需要生成具有特异于每一种特定靶序列的工程化、可程序化、序列特异性的DNA结合结构域的嵌合核酸酶。RNA引导的核酸酶(RNG)(诸如CRISPR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的多肽，其包含：a)与SEQ ID NO：1、2、4、5和7
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15中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：3或16具有至少81％序列同一性的氨基酸序列；或c)与SEQ ID NO：6具有至少82％序列同一性的氨基酸序列；其中所述多肽具有尿嘧啶稳定活性并且其中所述多肽还包含异源氨基酸序列。2.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽具有SEQ ID NO：33
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39中的任一个的序列。3.一种药物组合物，其包含非天然存在的药学上可接受的承载体和多肽，所述多肽包含：a)与SEQ ID NO：1、2、4、5和7
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15中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：3或16具有至少81％序列同一性的氨基酸序列；或c)与SEQ ID NO：6具有至少82％序列同一性的氨基酸序列；其中所述多肽具有尿嘧啶稳定活性。4.一种药物组合物，其包含非天然存在的药学上可接受的承载体和包含编码多肽的多核苷酸的核酸分子，所述多肽包含：a)与SEQ ID NO：1、2、4、5和7
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15中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：3或16具有至少81％序列同一性的氨基酸序列；或c)与SEQ ID NO：6具有至少82％序列同一性的氨基酸序列；其中所述多肽具有尿嘧啶稳定活性。5.权利要求3或4的药物组合物，其中所述多肽具有SEQ ID NO：33
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39中的任一个的序列。6.权利要求3
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5中任一项的药物组合物，其还包含氟嘧啶。7.一种包含编码多肽的多核苷酸的核酸分子，所述多肽包含：a)与SEQ ID NO：1、2、4、5和7
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15中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：3或16具有至少81％序列同一性的氨基酸序列；或c)与SEQ ID NO：6具有至少82％序列同一性的氨基酸序列；其中所述多肽具有尿嘧啶稳定活性；和其中所述核酸分子还包含可操作地连接至所述多核苷酸的异源启动子。8.权利要求7的核酸分子，其中所述多肽具有SEQ ID NO：33
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39中的任一个的序列。9.一种包含氟嘧啶和多肽的组合物，所述多肽包含：a)与SEQ ID NO：1、2、4、5和7
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15中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：3或16具有至少81％序列同一性的氨基酸序列；或c)与SEQ ID NO：6具有至少82％序列同一性的氨基酸序列；其中所述多肽具有尿嘧啶稳定活性。10.一种包含氟嘧啶和编码多肽的核酸分子的组合物，所述多肽包含：a)与SEQ ID NO：1、2、4、5和7
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15中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO：3或16具有至少81％序列同一性的氨基酸序列；或c)与SEQ ID NO：6具有至少82％序列同一性的氨基酸序列；其中所述多肽具有尿嘧啶稳定活性。11.权利要求9或10的组合物，其中所述多肽具有SEQ ID NO：33
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39中的任一个的序列。
12.一种融合蛋白，其包含：(i)DNA结合多肽；(ii)脱氨酶；和(iii)至少一种尿嘧啶稳定多肽(USP)，其与SEQ ID NO：1
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16中的任一个具有至少80％的序列同一性。13.权利要求12的融合蛋白，其中所述USP具有SEQ ID NO：33
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39中的任一个的序列。14.权利要求12或13的融合蛋白，其中所述脱氨酶是胞苷脱氨酶。15.权利要求14的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶是活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)或脱氨酶的载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族的成员。16.权利要求15的融合蛋白，其中所述胞苷脱氨酶包含与SEQ IDNO：47、48和76
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94中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。17.权利要求12
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16中任一项的融合蛋白，其中所述DNA结合多肽是大范围核酸酶、锌指融合蛋白或TALEN。18.权利要求12
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16中任一项的融合蛋白，其中所述DNA结合多肽是RNA引导的DNA结合多肽。19.权利要求18的融合蛋白，其中所述RNA引导的DNA结合多肽是RNA引导的核酸酶多肽(RGN)。20.权利要求19的融合蛋白，其中所述RGN是II型CRISPR
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Cas多肽。21.权利要求19的融合蛋白，其中所述RGN是V型CRISPR
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Cas多肽。22.权利要求19的融合蛋白，其中所述RGN包含与SEQ ID NO：40和95
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142中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。23.权利要求19
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22中任一项的融合蛋白，其中所述RGN是RGN切口酶。24.权利要求19
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23中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含RGN、胞苷脱氨酶和USP。25.权利要求24的融合蛋白，其中所述RGN与SEQ ID NO：40、41和95
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142中的任一个具有至少80％的序列同一性，所述胞苷脱氨酶与SEQ ID NO：47、48和76
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94中的任一个具有至少80％的序列同一性，并且所述USP与SEQ ID NO：1
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16中的任一个具有至少80％的序列同一性。26.权利要求12
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25中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含至少一个核定位信号(NLS)。27.一种包含编码融合蛋白的多核苷酸的核酸分子，所述融合蛋白包含：(i)DNA结合多肽；(ii)脱氨酶；和(iii)至少一种尿嘧啶稳定多肽(USP)，其中USP由以下核苷酸序列编码：a)与SEQ ID NO：17
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32中的任一个具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，b)在SEQ ID NO：17
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32中的任一个示出的核苷酸序列，c)编码与SEQ ID NO：1
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16至少80％相同的氨基酸序列并且进一步具有SEQ ID NO：33
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39中的任一个的序列的核苷酸序列，d)编码与SEQ ID NO：1
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16中的任一个示出的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的核苷酸序列，或e)编码SEQ ID NO：1
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16中的任一个示出的氨基酸序列的核苷酸序列。28.权利要求27的核酸分子，其中所述脱氨酶是胞苷脱氨酶。29.权利要求28的核酸分子，其中所述胞苷脱氨酶是活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)或脱氨酶的载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族的成员。
30.权利要求29的核酸分子，其中所述胞苷脱氨酶包含与SEQ IDNO：47、48和76
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94中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。31.权利要求27
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30中任一项的核酸分子，其中所述DNA结合多肽是大范围核酸酶、锌指融合蛋白或TALEN。32.权利要求27
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30中任一项的核酸分子，其中所述DNA结合多肽是RNA引导的DNA结合多肽。33.权利要求32的核酸分子，其中所述RNA引导的DNA结合多肽是RNA引导的核酸酶多肽(RGN)。34.权利要求33的核酸分子，其中所述RGN是II型CRISPR
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Cas多肽。35.权利要求33的核酸分子，其中所述RGN是V型CRISPR
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Cas多肽。36.权利要求33的核酸分子，其中所述RGN包含与SEQ ID NO：40和95
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142中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。37.权利要求33
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36中任一项的核酸分子，其中所述RGN是RGN切口酶。38.权利要求33
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36中任一项的核酸分子，其中所述融合蛋白包含RGN、胞苷脱氨酶和USP。39.权利要求38的核酸分子，其中所述RGN与SEQ ID NO：40、41和95
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142中的任一个具有至少80％的序列同一性，所述胞苷脱氨酶与SEQ ID NO：47、48和76
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94中的任一个具有至少80％的序列同一性，并且所述USP与SEQ ID NO：1
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16中的任一个具有至少80％的序列同一性。40.权利要求27
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39中任一项的核酸分子，其中编码融合蛋白的多核苷酸在其5'端可操作地连接至异源启动子。41.权利要求27
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39中任一项的核酸分子，其中编码融合蛋白的多核苷酸在其3'端可操作地连接至异源终止子。42.权利要求29
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41中任一项的核酸分子，其中所述融合蛋白包含一个或多个核定位信号。43.权利要求27
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42中任一项的核酸分子，其中所述融合蛋白针对在真核细胞中的表达进行了密码子优化。44.权利要求27
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43中任一项的核酸分子，其中所述融合蛋白针对在原核细胞中的表达进行了密码子优化。45.一种载体，其包含权利要求27
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44中任一项的核酸分子。46.一种包含权利要求33
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39中任一项的核酸分子的载体，其还包含编码能够与靶序列杂交的引导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列。47.权利要求46的载体，其中所述gRNA是单引导RNA。48.权利要求46的载体，其中所述gRNA是双引导RNA。49.一种细胞，其包含权利要求12
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26中任一项的融合蛋白。50.一种细胞，其包含权利要求18
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25中任一项的融合蛋白，其中所述细胞还包含引导RNA。51.一种细胞，其包含权利要求27
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44中任一项的核酸分子。52.一种细胞，其包含权利要求45至48中任一项的载体。
53.权利要求49
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52中任一项的细胞，其中所述细胞是原核细胞。54.权利要求49
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52中任一项的细胞，其中所述细胞是真核细胞。55.权利要求54的细胞，其中所述细胞是昆虫、鸟类或哺乳动物细胞。56.权利要求54的细胞，其中所述细胞是植物细胞或真菌细胞。57.一种药物组合物，其包含药学上可接受的承载体和权利要求7、8、27
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44中任一项的核酸分子、权利要求9
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11中任一项的组合物、权利要求12
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26中任一项的融合蛋白、权利要求45
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48任一项的载体或权利要求49
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55任一项的细胞。58.一种制备融合蛋白的方法，包括在表达融合蛋白的条件下培养权利要求49
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56中任一项的细胞。59.一种制备融合蛋白的方法，包括将权利要求27
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44中任一项的核酸分子或权利要求45
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48中任一项的载体引入细胞中并在表达融合蛋白的条件下培养细胞。60.权利要求58或59的方法，还包括纯化所述融合蛋白。61.一种制备RGN融合核糖核蛋白复合物的方法，包括将权利要求33
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39中任一项的核酸分子和包含编码引导RNA的表达盒的核酸分子或权利要求46
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48中任一项的载体引入细胞中，以及在表达融合蛋白和gRNA并形成RGN融合核糖核蛋白复合物的条件下培养细胞。62.权利要求61的方法，还包括纯化所述RGN融合核糖核蛋白复合物。63.一种用于修饰包含靶DNA序列的靶DNA分子的系统，所述系统包括：a)包含RNA引导的核酸酶多肽(RGN)、胞苷脱氨酶和至少一种尿嘧啶稳定多肽(USP)的融合蛋白，其中USP与...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：生命编辑制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：