【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA修饰酶及其活性片段和变体以及使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请案要求
2021
年3月
22
日提交的第
63/164,273
号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用整体地被并入本文
。
[0003]关于序列表的声明
[0004]与本申请相关的序列表以
ASCII
格式代替纸质副本提供，其通过引用并入本说明书中
。
该
ASCII
副本名为
L103438_1240WO_0134_1_SL.txt
，大小为
1,310,113
字节，创建于
2022
年3月
22
日，在此通过
EFS Web
以电子方式提交
。
[0005]本专利技术涉及分子生物学及基因编辑领域
。
技术介绍
[0006]靶向基因组编辑或修饰正迅速成为基础及应用研究的重要工具
。
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种多肽，其包含从由下述组成的群组选出的氨基酸序列：
a)
与
SEQ ID NO
：2及7‑
12
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列；以及
b)
与
SEQ ID NO
：4或6具有至少
95
％序列同一性的氨基酸序列；其中该多肽具有脱氨酶活性
。2.
根据权利要求1所述的多肽，其包括与
SEQ ID NO
：
2、4
及6‑
12
中任一个具有
100
％序列同一性的氨基酸序列
。3.
一种核酸分子，其包括编码脱氨酶多肽的多核苷酸，其中所述脱氨酶由从由下述组成的群组选出的核苷酸序列编码：
a)
与
SEQ ID NO
：
114
‑
119
中任一个具有至少
80
％序列同一性的核苷酸序列；
b)
与
SEQ ID NO
：
109、111
及
113
中任一个具有至少
95
％序列同一性的核苷酸序列；
c)
编码与
SEQ ID NO
：2及7‑
12
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；以及
d)
编码与
SEQ ID NO
：4或6具有至少
95
％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列
。4.
根据权利要求3所述的核酸分子，其中所述脱氨酶由与
SEQ ID NO
：
114
‑
119
中任一个具有至少
90
％序列同一性的核苷酸序列编码
。5.
根据权利要求3所述的核酸分子，其中所述脱氨酶由与
SEQ ID NO
：
109、111
及
113
‑
119
中任一个具有
100
％序列同一性的核苷酸序列编码
。6.
根据权利要求3所述的核酸分子，其中所述脱氨酶多肽具有与
SEQ ID NO
：
2、4
及6‑
12
中任一个具有
100
％序列同一性的氨基酸序列
。7.
根据权利要求3‑6中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子进一步包括可操作地连接至该多核苷酸的异源启动子
。8.
一种载体，其包含根据权利要求3‑7中任一项所述的核酸分子
。9.
一种细胞，其包含根据权利要求3‑7中任一项所述的核酸分子或根据权利要求8所述的载体
。10.
一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体以及根据权利要求1或2所述的多肽
、
根据权利要求3‑7中任一项所述的核酸分子
、
根据权利要求8所述的载体或根据权利要求9所述的细胞
。11.
一种用于制造脱氨酶的方法，其中包括：在该脱氨酶被表达的条件下，培养根据权利要求9所述的细胞
。12.
一种用于制造脱氨酶的方法，其中包括将根据权利要求3‑7中任一项所述的核酸分子或根据权利要求8所述的载体引入细胞中以及在该脱氨酶被表达的条件下培养该细胞
。13.
根据权利要求
11
或
12
所述的方法，进一步包括纯化该脱氨酶
。14.
一种融合蛋白，其包含
DNA
结合多肽以及具有从由下述组成的群组选出的氨基酸序列的脱氨酶：
a)
与
SEQ ID NO
：2及7‑
12
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列；以及
b)
与
SEQ ID NO
：4或6具有至少
95
％序列同一性的氨基酸序列
。15.
根据权利要求
14
所述的融合蛋白，其中所述脱氨酶与
SEQ ID NO
：
2、4
及6‑
12
中任一个具有
100
％序列同一性
。16.
根据权利要求
14
或
15
所述的融合蛋白，其中所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶
。
17.
根据权利要求
14
‑
16
中任一项所述的融合蛋白，其中所述
DNA
结合多肽为大范围核酸酶
、
锌指融合蛋白或
TALEN
；或大范围核酸酶
、
锌指融合蛋白或
TALEN
的变体，其中所述核酸酶活性已被降低或抑制
。18.
根据权利要求
14
‑
16
中任一项所述的融合蛋白，其中所述
DNA
结合多肽为
RNA
引导的
DNA
结合多肽
。19.
根据权利要求
18
所述的融合蛋白，其中所述
RNA
引导的
DNA
结合多肽为
RNA
引导的核酸酶
(RGN)
多肽
。20.
根据权利要求
19
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
为
II
型或
V
型
CRISPR
‑
Cas
多肽
。21.
根据权利要求
19
或
20
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
为
RGN
切口酶
。22.
根据权利要求
21
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
切口酶具有无活性的
RuvC
域
。23.
根据权利要求
19
或
20
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
为核酸酶无活性的
RGN。24.
根据权利要求
19
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
具有与表1中的
RGN
序列中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。25.
根据权利要求
19
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
具有表1中的
RGN
序列中任一个的氨基酸序列
。26.
根据权利要求
19
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
具有与
SEQ ID NO
：
74、82、87、106
及
107
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。27.
根据权利要求
19
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
具有
SEQ ID NO
：
74、82、87、106
及
107
中任一个的氨基酸序列
。28.
根据权利要求
21
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
切口酶具有与
SEQ ID NO
：
75
及
88
‑
98
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。29.
根据权利要求
21
所述的融合蛋白，其中所述
RGN
切口酶具有包含
SEQ ID NO
：
75
及
88
‑
98
中任一个的氨基酸序列
。30.
根据权利要求
14
‑
29
中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包括至少一个核定位信号
(NLS)。31.
根据权利要求
14
‑
30
中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白进一步包括尿嘧啶稳定蛋白
(USP)。32.
根据权利要求
31
所述的融合蛋白，其中所述
USP
具有如
SEQ ID NO
：
81
所示的序列
。33.
根据权利要求
14
所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有
SEQ ID NO
：
67、68、146
及
147
中任一个的氨基酸序列
。34.
一种核酸分子，其包含编码融合蛋白的多核苷酸，该融合蛋白包括
DNA
结合多肽及脱氨酶，其中所述脱氨酶由从由下述组成的群组选出的核苷酸序列编码：
a)
与
SEQ ID NO
：
114
‑
119
中任一个具有至少
80
％序列同一性的核苷酸序列；
b)
与
SEQ ID NO
：
109、111
及
113
中任一个具有至少
95
％序列同一性的核苷酸序列；
c)
编码与
SEQ ID NO
：2及7‑
12
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列；以及
d)
编码与
SEQ ID NO
：4或6具有至少
95
％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列
。35.
根据权利要求
34
所述的核酸分子，其中所述脱氨酶由与
SEQ ID NO
：
114
‑
119
中任一个具有至少
90
％序列同一性的核苷酸序列编码
。
36.
根据权利要求
34
所述的核酸分子，其中所述脱氨酶核苷酸序列与
SEQ ID NO
：
109、111
及
113
‑
119
中任一个具有
100
％序列同一性
。37.
根据权利要求
34
所述的核酸分子，其中所述脱氨酶核苷酸序列编码与
SEQ ID NO
：
2、4
及6‑
12
中任一个具有
100
％序列同一性的氨基酸序列
。38.
根据权利要求
34
‑
37
中任一项所述的核酸分子，其中所述脱氨酶为胞嘧啶脱氨酶
。39.
根据权利要求
34
‑
38
中任一项所述的核酸分子，其中所述
DNA
结合多肽为大范围核酸酶
、
锌指融合蛋白或
TALEN
；或大范围核酸酶
、
锌指融合蛋白或
TALEN
的变体，其中所述核酸酶活性已被降低或抑制
。40.
根据权利要求
34
‑
38
中任一项所述的核酸分子，其中所述
DNA
结合多肽为
RNA
引导的
DNA
结合多肽
。41.
根据权利要求
40
所述的核酸分子，其中所述
RNA
引导的
DNA
结合多肽为
RNA
引导的核酸酶
(RGN)
多肽
。42.
根据权利要求
41
所述的核酸分子，其中所述
RGN
为
II
型或
V
型
CRISPR
‑
Cas
多肽
。43.
根据权利要求
41
或
42
所述的核酸分子，其中所述
RGN
为
RGN
切口酶
。44.
根据权利要求
43
所述的核酸分子，其中所述
RGN
切口酶具有无活性的
RuvC
域
。45.
根据权利要求
41
或
42
所述的核酸分子，其中所述
RGN
为核酸酶无活性的
RGN。46.
根据权利要求
41
所述的核酸分子，其中所述
RGN
具有与表1中的
RGN
序列中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。47.
根据权利要求
41
所述的核酸分子，其中所述
RGN
具有表1中的
RGN
序列中任一个的氨基酸序列
。48.
根据权利要求
41
所述的核酸分子，其中所述
RGN
具有与
SEQ ID NO
：
74、82、87、106
及
107
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。49.
根据权利要求
41
所述的核酸分子，其中所述
RGN
具有
SEQ ID NO
：
74、82、87、106
及
107
中任一个的氨基酸序列
。50.
根据权利要求
43
所述的核酸分子，其中所述
RGN
切口酶具有与
SEQ ID NO
：
75
及
88
‑
98
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。51.
根据权利要求
43
所述的核酸分子，其中所述
RGN
切口酶具有包含
SEQ ID NO
：
75
及
88
‑
98
中任一个的氨基酸序列
。52.
根据权利要求
34
‑
51
中任一项所述的核酸分子，其中编码该融合蛋白的该多核苷酸在其
5'
端处可操作地连接至启动子
。53.
根据权利要求
34
‑
52
中任一项所述的核酸分子，其中编码该融合蛋白的该多核苷酸在其
3'
端处可操作地连接至终止子
。54.
根据权利要求
34
‑
53
中任一项所述的核酸分子，其中所述融合蛋白包括一个或多个核定位信号
。55.
根据权利要求
34
‑
54
中任一项所述的核酸分子，其中所述融合蛋白针对于真核细胞中的表达而进行了密码子优化
。56.
根据权利要求
34
‑
55
中任一项所述的核酸分子，其中所述融合蛋白针对于原核细胞中的表达而进行了密码子优化
。57.
根据权利要求
34
‑
56
中任一项所述的核酸分子，其中所述融合蛋白进一步包括尿嘧
啶稳定蛋白
(USP)。58.
根据权利要求
57
所述的核酸分子，其中所述
USP
具有如
SEQ ID NO
：
81
所示的序列
。59.
根据权利要求
34
所述的核酸分子，其中所述融合蛋白具有
SEQ ID NO
：
67、68、146
及
147
中任一个所示的氨基酸序列
。60.
一种载体，其包含根据权利要求
34
‑
59
中任一项所述的核酸分子
。61.
根据权利要求
60
所述的载体，进一步包括编码能够与靶序列杂交的引导
RNA(gRNA)
的至少一个核苷酸序列
。62.
一种细胞，其包含根据权利要求
14
‑
33
中任一项所述的融合蛋白
。63.
根据权利要求
62
所述的细胞，其中所述细胞进一步包括引导
RNA。64.
一种细胞，其包含根据权利要求
34
‑
59
中任一项所述的核酸分子
。65.
一种细胞，其包含根据权利要求
60
或
61
所述的载体
。66.
一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体以及根据权利要求
14
‑
33
中任一项所述的融合蛋白
、
根据权利要求
34
‑
59
中任一项所述的核酸分子
、
根据权利要求
60
或
61
所述的载体
、
或根据权利要求
62
‑
65
中任一项所述的细胞
。67.
一种用于制造融合蛋白的方法，其中包括：在该融合蛋白被表达的条件下，培养根据权利要求
62
‑
65
中任一项所述的细胞
。68.
一种用于制造融合蛋白的方法，其中包括将根据权利要求
34
‑
59
中任一项所述的核酸分子或根据权利要求
60
或
61
所述的载体引入细胞中
、
以及在该融合蛋白被表达的条件下培养该细胞
。69.
根据权利要求
67
或
68
所述的方法，进一步包括纯化该融合蛋白
。70.
一种用于制造
RGN
融合核糖核蛋白复合物的方法，其中包括将根据权利要求
34
‑
59
中任一项所述的核酸分子及包括编码引导
RNA
的表达盒的核酸分子
、
或根据权利要求
60
或
61
所述的载体引入细胞中；以及在该融合蛋白及该
gRNA
被表达且形成
RGN
融合核糖核蛋白复合物的条件下，培养该细胞
。71.
根据权利要求
70
所述的方法，进一步包括纯化该
RGN
融合核糖核蛋白复合物
。72.
一种用于修饰包括靶
DNA
序列的靶
DNA
分子的系统，该系统包括：
a)
融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白包括
RNA
引导的核酸酶多肽
(RGN)
以及脱氨酶，其中所述脱氨酶具有从由下述组成的群组选出的氨基酸序列：
i)
与
SEQ ID NO
：2及7‑
12
中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列；以及
ii)
与
SEQ ID NO
：4或6具有至少
95
％序列同一性的氨基酸序列；以及
b)
能够与该靶
DNA
序列杂交的一个或多个引导
RNA、
或编码该一个或多个引导
RNA(gRNA)
的一个或多个核苷酸序列；以及其中所述一个或多个引导
RNA
能够与该融合蛋白形成复合物，以引导该融合蛋白与该靶
DNA
序列结合及修饰该靶
DNA
分子
。73.
根据权利要求
72
所述的系统，其中所述脱氨酶具有与
SEQ ID NO
：
2、4
及6‑
12
中的至少一个具有
100
％序列同一性的氨基酸序列
。74.
根据权利要求
72
或
73
所述的系统，其中编码该一个或多个引导
RNA
的该核苷酸序列和编码该融合蛋白的该核苷酸序列中的至少一个可操作地连接至启动子
。75.
根据权利要求
72
‑
74
中任一项所述的系统，其中所述靶
DNA
序列被定位为与由该
RGN
识别的原间隔序列邻近基序
(protospacer adjacent motif
，
PAM)
相邻
。76.
根据权利要求
72
‑
75
中任一项所述的系统，其中所述靶
DNA
分子在细胞内
。77.
根据权利要求
72
‑
76
中任一项所述的系统，其中所述融合蛋白的该
RGN
为
II
型或
V
型
CRISPR
‑
Cas
多肽
。78.
根据权利要求
72
‑
76
中任一项所述的系统，其中所述融合蛋白的该
RGN
具有与表1中的
RGN
序列中任一个具有至少
90
％序列同一性的氨基酸序列
。79.
根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：生命编辑制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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