Cas13制造技术

本发明专利技术涉及一种分离的

【技术实现步骤摘要】
Cas13蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种
Cas13
蛋白及其应用
。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas13
是一种基于细菌免疫系统的
RNA
靶向和编辑系统，可保护细菌免受病毒侵害
。CRISPR
‑
Cas13
系统类似于
CRISPR
‑
Cas9
系统，但与靶向
DNA
的
Cas9
蛋白不同，
Cas13
蛋白靶向
RNA。
[0003]CRISPR
‑
Cas13
属于
Type VI CRISPR
‑
Cas13
系统，它包含一个单一的效应蛋白
Cas13。
目前，
CRISPR
‑
Cas13
根据系统发育可分为多个亚型（如
Cas13a、Cas13b、Cas13c
和
Cas13d
）
。
然而，目前对于发现尺寸紧凑（例如，适用于
AAV
递送）
、
在哺乳动物细胞中编辑效率高（例如，
RNA
靶向
/
切割活性）和
/
或细胞毒性低（例如，旁式
RNA
降解引起的细胞休眠和细胞凋亡，或者脱靶）的新
Cas13
系统仍存在迫切的需求
。

技术实现思路

[0004]本专利技术一方面涉及一种分离的
Cas13
蛋白，其氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
70%、
至少
80%、
至少
85%、
至少
90%、
至少
95%、
至少
98%、
至少
99%
或
100%
的序列同一性
。
[0005]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白能够与指导多核苷酸形成
CRISPR
复合物，所述指导多核苷酸包含与指导序列连接的同向重复序列，所述指导序列被工程化与靶
RNA
杂交
。
其中“工程化”指基于靶序列进行设计的过程，以达到预期目的，如可针对性的与靶
RNA
杂交等
。
[0006]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白能够与指导多核苷酸形成
CRISPR
复合物，所述
CRISPR
复合物能够与靶
RNA
序列特异性结合
。
[0007]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白能够与指导多核苷酸形成
CRISPR
复合物，所述
CRISPR
复合物能够序列特异性地结合并切割靶
RNA。
[0008]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白能够与指导多核苷酸形成
CRISPR
复合物，所述指导多核苷酸包含与指导序列连接的同向重复序列，所述指导序列被工程化以指导所述
CRISPR
复合物与靶
RNA
的序列特异性结合
。
[0009]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白能够与指导多核苷酸形成
CRISPR
复合物，所述指导多核苷酸包含与指导序列连接的同向重复序列，所述指导序列被工程化以指导所述
CRISPR
复合物序列特异性地结合并切割靶
RNA。
[0010]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
80%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
90%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
95%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
96%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
97%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
98%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
99%
的序列同一性
。
在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列与
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项相比具有至少
99.5%
的序列同一性
。
[0011]在一些实施方案中，所述
Cas13
蛋白的氨基酸序列如
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项所示
。
[0012]本专利技术的序列为
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项的
Cas13
蛋白是基于
NCBI
和
CNGB
数据库中原核基因组和宏基因组的生物信息学分析以及后续的活性验证而鉴定得到
。
[0013]在一些实施方案中，本专利技术所述
Cas13
蛋白来自：包含与
NCBI
数据库中编号为
GCA_016648615.1
所示基因组的平均核苷酸同一性（
ANI
）
≥95%
的基因组的物种（
species
）；或包含与
CNGB
数据库中编号为
CNA0007821
所示基因组的平均核苷酸同一性（
ANI
）
≥95%
的基因组的物种（
species
）
。
[0014]平均核苷酸同一性（本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种分离的
Cas13
蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为
SEQ ID NO: 1
‑3中任一项所示
。2.
一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的
Cas13
蛋白和蛋白功能结构域，所述蛋白功能结构域为蛋白结构域和多肽标签中的至少一种
。3.
根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述
Cas13
蛋白与核定位信号或核输出信号融合
。4.
根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述
Cas13
蛋白融合至选自以下的任意一种或两种以上蛋白功能结构域：胞嘧啶脱氨酶结构域
、
腺嘌呤脱氨酶结构域
、
翻译激活结构域
、
翻译抑制结构域
、RNA
甲基化结构域
、RNA
去甲基化结构域
、
核酸酶结构域
、
剪接因子结构域
、
报告域
、
亲和域
、
亚细胞定位信号
、
报告标签和亲和标签
。5. 一种
CRISPR
‑
Cas13
系统，其特征在于，其包含：如权利要求1所述的
Cas13
蛋白或如权利要求2‑4任一项所述的融合蛋白，或编码所述
Cas13
蛋白或融合蛋白的核酸；以及指导多核苷酸或编码所述指导多核苷酸的核酸；所述指导多核苷酸能够与所述
Cas13
蛋白或融合蛋白形成
CRISPR
复合物并引导所述
CRISPR
复合物与靶
RNA
的序列特异性结合
。6. 根据权利要求5所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统，其特征在于，所述指导多核苷酸包含连接的指导序列和同向重复序列，所述同向重复序列为
SEQ ID NO: 4
‑6中任一项
。7.
根据权利要求5所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统，其特征在于，所述指导多核苷酸包含修饰的核苷酸
。8.
根据权利要求7所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统，其特征在于，所述修饰任选自
2'
‑
O
‑
甲基
、2'
‑
O
‑
甲基
‑
3'
‑
硫代磷酸酯或
2'
‑
O
‑
甲基
‑
3'
‑
硫代
PACE
修饰
。9. 根据权利要求5所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统，所述靶
RNA
任选自
TTR RNA、SOD1 RNA、PCSK9 RNA、VEGFA RNA、VEGFR1 RNA、PTBP1 RNA、AQp1 RNA
和
ANGPTL3 RNA。10.
一种包含如权利要求5‑9任一项所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统的载体系统，其中，所述载体系统包含一个或多个载体，所述载体包含编码所述
Cas13
蛋白或融合蛋白的多核苷酸序列和编码所述指导多核苷酸的多核苷酸序列
。11.
一种包含如权利要求5‑9任一项所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统的腺相关病毒载体，其中，所述腺相关病毒载体包含编码所述
Cas13
蛋白或融合蛋白和指导多核苷酸的
DNA。12.
一种包含如权利要求5‑9任一项所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统的脂质纳米粒，其中，所述脂质纳米粒包含所述的指导多核苷酸和编码所述
Cas13
蛋白或融合蛋白的
mRNA。13.
一种包含如权利要求5‑9任一项所述的
CRISPR
‑
Cas13
系统的慢病毒载体，其中，所述慢病毒载体包含所述指导...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁峻彬，梁兴祥，陈重建，孙阳，潘伟业，徐辉，司凯威，李秋婷，周琳，张海辉，
申请(专利权)人：浙江迅识生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：