【技术实现步骤摘要】
受化学小分子诱导重新组装的CRISPR/CasRx系统及其应用
[0001]本专利技术属于基因编辑和基因治疗
,具体涉及一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统及其应用
。
技术介绍
[0002]CRISPR/Cas
系统是细菌抵御外来病毒入侵的适应性免疫系统,基于此类系统开发的各类基因编辑技术从很大程度上推动了生物医学中各个领域的研究进展
。
从安全性角度来讲,应用
CRISPR/Cas9
系统直接在体内敲除某一特定基因会永久破坏该基因的下游生物学功能,并且其引起基因组层面的脱靶也会持续传递至子代细胞中,导致
CRISPR/Cas9
系统在临床应用上面临严重安全隐患
。
[0003]CRISPR/Cas13
系统是一种特异靶向单链
RNA
分子的
II
类
VI
型
CRISPR/Cas
系统
。
因为其靶向
RNA
而不影响
DNA
,
CRISPR/Cas13
系统不会影响细胞基因组的完整性
。
在
Cas13
蛋白家族中,黄化瘤胃球菌
XPD3002
的
Cas13d
蛋白
(RfxCas13d
,简称
CasRx)
对哺乳动物细胞中的
mRNA />表现出很高的靶向沉默效率
。
相较于传统的
RNA
干扰技术,
CasRx
兼具敲低效率高和脱靶率低的优势
。
目前,
CasRx
已经被广泛应用于细胞系
、
动物胚胎组织和动物成体组织内部降解和沉默目标
RNA。
因为
CRISPR/CasRx
系统具有高效率
、
低脱靶率和高安全性等优势,所以将其递送至体内并靶向沉默目标
RNA
具有很好的临床应用前景
。
然而,
CRISPR/Cas
系统在体内应用方面仍面临着诸多安全隐患,包括
Cas
蛋白的免疫原性和过量表达引起的高脱靶率等
。
所以,实现特定类型细胞内
CasRx
蛋白的精确表达并能够控制其表达时间和强度对于增加其体内应用的安全性有重要意义
。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是在现有技术的基础上,提供一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统,及其制备方法和应用
。
本专利技术的系统能够配合相应
gRNA
在化学小分子的诱导下高效并可控地靶向敲低特定
mRNA
,并降低了脱靶率
。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下措施达到:
[0006]一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统,简称为
sCasRx.v1
系统,它包括的
NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白和
NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
融合蛋白,二者能够在化学小分子物质的诱导下聚合成完整的
CasRx
蛋白;其中:
[0007]NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白的
DNA
序列如
SEQ NO.1
所示,其氨基酸序列如
SEQ NO.5
所示,其简称为
CasRx(N)
‑
FRB
融合蛋白或
CasRx(N)
‑
FRB
;
[0008]NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
融合蛋白的
DNA
序列如
SEQ NO.2
所示,其氨基酸序列如
SEQ NO.6
所示,其简称为
FKBP
‑
CasRx(C)
融合蛋白或
FKBP
‑
CasRx(C)。
[0009]本专利技术提供了一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统的制备方法:将
CasRx
蛋白内部两个
RNA
内切酶结构域
HEPN
均分至
N
端和
C
端的原则,设计
N/C
端切割组合方式,分割位点包括非结构区和结构区,获得
CasRx(N)
片段和
CasRx(C)
片段;合成获得雷帕
霉素响应元件
FRB
和
FKBP
的
DNA
序列,并利用
ClonExpress
试剂盒分别将
CasRx(N)
片段和
FRB
片段
、CasRx(C)
片段和
FKBP
片段重组至
pCDNA3.1
载体中,基因片段间由长度为
18
氨基酸的
XTEN
连接子连接;构建得到
NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
和
NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
质粒
。
[0010]本专利技术提供了另一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统,简称为
sCasRx.v2
系统,它包括的
NLS
‑
CasRx(N)#3
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白和
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)#3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.
一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统,其特征在于它包括的
NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白和
NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
融合蛋白,二者能够在化学小分子物质的诱导下聚合成完整的
CasRx
蛋白;其中:所述
NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白的
DNA
序列如
SEQ NO.1
所示;所述
NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
融合蛋白的
DNA
序列如
SEQ NO.2
所示
。2.
根据权利要求1所述的受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统,其特征在于所述
NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白的氨基酸序列如
SEQ NO.5
所示;所述
NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
融合蛋白的氨基酸序列如
SEQ NO.6
所示
。3.
权利要求1所述的受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统的制备方法,其特征在于将
CasRx
蛋白内部两个
RNA
内切酶结构域
HEPN
均分至
N
端和
C
端的原则,设计
N/C
端切割组合方式,分割位点包括非结构区和结构区,获得
CasRx(N)
片段和
CasRx(C)
片段;合成获得雷帕霉素响应元件
FRB
和
FKBP
的
DNA
序列,并利用
ClonExpress
试剂盒分别将
CasRx(N)
片段和
FRB
片段
、CasRx(C)
片段和
FKBP
片段重组至
pCDNA3.1
载体中,基因片段间由长度为
18
氨基酸的
XTEN
连接子连接;构建得到
NLS
‑
CasRx(N)
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
和
NLS
‑
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)
‑
NLS
‑
HA
质粒
。4.
一种受化学小分子诱导重新组装的
CRISPR/CasRx
系统,其特征在于它包括的
NLS
‑
CasRx(N)#3
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白和
FKBP
‑
XTEN
‑
CasRx(C)#3
‑
NES
‑
HA
融合蛋白,二者能够在化学小分子物质的诱导下聚合成完整的
CasRx
蛋白;其中:所述
NLS
‑
CasRx(N)#3
‑
XTEN
‑
FRB
‑
NLS
‑
FLAG
融合蛋白的
DNA
序列如
SEQ NO.3
所示;所述
...
【专利技术属性】
技术研发人员:李阳,孙强,
申请(专利权)人:浙江大学医学院附属第四医院,
类型:发明
国别省市:
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