一种去制造技术

本发明专利技术提供了一种去除

【技术实现步骤摘要】
一种去gDNA的组合物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，涉及用于逆转录前
RNA
样本处理以去除
RNA
中的
gDNA
的污染的组合物
。

技术介绍

[0002]由于
RNA
体外不稳定的特性，对于
RNA
的研究往往需要通过逆转录将
RNA
逆转录成为
cDNA
，因此逆转录是
RNA
研究的最常见的分子生物学技术之一
。
但受到现有技术限制，磁珠法
、
过柱法或提取法提取的
RNA
都存在无法完全避免基因组
DNA
的残留的问题，残留的
DNA
进入下游实验可能导致实验结果误读，在一些场景中，例如
qPCR
，可通过定向设计跨越内含子的引物来避免基因组
DNA
对于实验结果的影响，但此类方式容易受到基因结构
、
物种的构成的影响
(
原核生物基因组不存在真核生物中的内含子结构，一些基因也不存在内含子结构
)。
为了解决这个问题，人们需要对提取的
RNA
去除
gDNA
的污染，如通过
DNA
酶消化后进行
RNA
的再次纯化或化学沉淀法分离
RNA
与
DNA。
[0003]随着技术的发展，一些逆转录试剂中匹配
DNA
去除模块，因此，不需要对提取的
RNA
进行额外处理，大大简化了实验流程
。
逆转录试剂中匹配的
DNA
去除模块往往以各类
DNA
酶为主要工作蛋白，匹配以适当的缓冲，以达成逆转录前去除
RNA
样本中
DNA
的目的
。DNase
酶活去除方式与
DNase
自身的特性直接相关
。
例如，去基因组模块中选用的为热敏感
DNase
，则后续减酶活方法可通过提高
RT
反应温度来实现；去基因组模块中选择的为盐敏感
DNase
，则后续主要通过
RT
模块中较高的离子浓度来进行
DNase
活性的减弱
。
[0004]尽管有多重方法在
RT
反应进行时减低
DNase
的活性，但受限于失活强度，实际中，
DNase
用量都无法达到一个较高的程度，一般低于
20U/
反应
。
因此，在实际使用中，如果无法保证充足的反应时间，
DNase
切割后的底物可能仍有较大的概率成为下游
DNA
聚合酶的模板
。
因此，在计算清除效率的时候，无法达到
100
％
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的在于提供一种去除
RNA
中
gDNA
污染的组合物，具体涉及切割双链
DNA
的酶和具有
DNA
缺口处切割能力的酶的组合物
。
[0006]本专利技术提供给一种酶组合物，包含切割双链
DNA
的酶和核酸外切酶或切割双链
DNA
的酶和核酸内切酶
。
在一些实施方案中，切割双链
DNA
的酶选自
DNase I、dsDNase。
[0007]在一些实施方案中，所述核酸外切酶选自
T7
核酸外切酶
、T5
核酸外切酶
、
核酸外切酶
III、
核酸外切酶
VIII、
核酸外切酶
I、
核酸外切酶
VII。
在一些实施方案中，所述核酸内切酶选自
T7
内切酶
I、
核酸内切酶
VIII、
核酸内切酶
V、
核酸内切酶
IV、
核酸内切酶
III
，优选
T7
内切酶
I。
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种反应液，利用该反应液去除
RNA
中
gDNA
，改善了去基因组模块的清除效果
。
[0009]本专利技术提供了一种反应液，包括第一目的所述的酶组合物和缓冲液
。
[0010]在一些实施方案中，所述酶组合物包含切割双链
DNA
的酶和核酸外切酶
。
在一些实施方案中，所述切割双链
DNA
的酶选自
DNase I
或
dsDNase
，所述核酸外切酶选自
T7
核酸外切酶
、T5
核酸外切酶
、
核酸外切酶
III、
核酸外切酶
VIII、
核酸外切酶
I、
核酸外切酶
VII。
在一些实施方案中，所述酶组合物包含切割双链
DNA
的酶和核酸内切酶
。
所述核酸内切酶选自
T7
内切酶
I、
核酸内切酶
VIII、
核酸内切酶
IV、
核酸内切酶
V
或核酸内切酶
III
，优选
T7
内切酶
I。
[0011]在一些实施方案中，所述
DNase I
在去
gDNA
的反应体系浓度是1‑
20U/
μ
L
，优选1‑
15U/
μ
L
，优选1‑
10U/
μ
L
，更优选1‑
5U/
μ
L
，具体可选自
1U/
μ
L、2U/
μ
L、3U/
μ
L、4U/
μ
L、5/
μ
L、6U/
μ
L、7U/
μ
L、8/
μ
L、9U/
μ
L、10U/
μ
L、11U/
μ
L、12U/
μ
L、13U/
μ
L、14U/
μ
L、15/
μ
L、16U/
μ
L、17U/
μ
L、18/
μ
L、19U/
μ
L
和
20U/
μ...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种组合物，包含切割双链
DNA
的酶和核酸内切酶或切割双链
DNA
的酶和核酸外切酶，其中所述切割双链
DNA
的酶选自
DNase I、dsDNase。2.
根据权利要求1的组合物，所述核酸外切酶选自
T7
核酸外切酶
、T5
核酸外切酶
、
核酸外切酶
III、
核酸外切酶
VIII、
核酸外切酶
VII。3.
根据权利要求1的组合物，所述核酸内切酶选自
T7
内切酶
I、
核酸内切酶
VIII、
核酸内切酶
V、
核酸内切酶
IV
和核酸内切酶
III
，优选
T7
内切酶
I。4.
一种反应液，所述反应液包括权利要求1‑3任一项所述的组合物和缓冲液
。5.
根据权利要求4的反应液，包含
DNase I
，所述
DNase I
浓度是1‑
20U/
μ
L
，优选1‑
15U/
μ
L
，优选1‑
10U/
μ
L
，优选1‑
5U/
μ
L
，更优选
2U/
μ
L
；或包含
dsDNase
，所述
dsDNase
浓度是1‑
20U/
μ
L
，优选1‑
15U/
μ
L
，优选5‑
15U/
μ
L
，更优选
2U/
μ
L
；还包含
T7
内切酶
I
，所述
T7
内切酶
I
浓度是
0.1
‑
20U/
μ
L
，优选
0.1
‑
10U/
μ
L
，优选
0.1
‑
5U/
μ
L
，更优选
1U/
μ
L。6.
根据权利要求4的反应液，所述缓冲液包含
Tris
‑
HCl
，
Mg2+、Ca2+
和甘油；所述
Tris
‑
HCl
浓度是5‑
50mmol/L
，优选
50mM
；所述
Mg
2+
是2‑
20mmol/L
的
MgCl2，优选
10mM
；所述
Ca
2+
是1‑
10mmol/L
的
CaCl2，优选
5mM
；所述甘油浓度是
10
‑
40
％
(v/v)
，优选
3...

【专利技术属性】
技术研发人员：瞿志鹏，吴恒，樊安琪，谈忠鸣，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心江苏省公共卫生研究院，
类型：发明
国别省市：