新的制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域

【技术实现步骤摘要】
新的CRISPR基因编辑系统


[0001]本专利技术属于基因工程领域
。
具体而言，本专利技术涉及一种新的
CRISPR
基因编辑系统及其应用
。
更具体而言，本专利技术提供了一种转座子与
CRISPR
‑
Cas12
中间体
(TraC)
效应蛋白或其功能性变体，以及基于其的基因编辑系统及其应用
。
[0002]专利技术背景
[0003]Type V
类型的效应蛋白为具有多个功能域的
Cas12
蛋白，其标志性的特征为包含类
RuvC
结构域，该结构域一般负责靶
DNA
的切割
。Type V
的亚型非常丰富，目前已发现并分类的亚型包括
Cas12a
‑
k
共计
11
种亚型，其中
Cas12a
与
Cas12b
已经被开发成高效的真核生物基因编辑系统
。Cas12a
也被称作
Cpf1
蛋白，包括一个与
Cas9
蛋白或
TnpB
蛋白类似的
RuvC
‑
like
的结构域，但与
Cas9
相比，
Cas12a
家族蛋白缺乏
HNH
结构域，仅使用
RuvC
结构域切割
DNA
的两条链
。Cas12b
在最初被挖掘到时被称作
C2c1(Class 2Candidate 1)
，其
C
端序列与
IS605
家族的
TnpB
蛋白非常相似，但并不与其他
Class II
家族的蛋白有显著的序列相似性
。
其
Cas
基因包括
Cas1/Cas4
的融合基因
、Cas2、
与
Cas12b
基因
。
其
crRNA
的成熟也需要
trRNA
的参与
。Cas12c
在最初被称为
C2c3(Class 2Candidate 3)
，其
Cas
基因仅包括
Cas1
与
Cas12c
基因，
Cas12c
基因仅与
Cpf1
的
TnpB
同源序列部分具有有限的相似性
。
[0004]得益于生物信息分析方法的改进，
Type V
类型的亚型数量近年来有了爆发性的增长，包括
Cas12a、Cas12b
与
Cas12c
蛋白在内，共计
10
种
Type V
的亚型被发现
。
关于这些亚型的核酸干涉活性也逐渐被实验证明
。
如
Arbor
生物技术公司的科学家通过体外实验证明了来自
Type V
‑
C、Type V
‑
G、Type V
‑
H、Type V
‑
I
的效应蛋白
Cas12c、Cas12g、Cas12h
和
Cas12i
的
DNA
双链切割活性
。
此外，
Type V
‑
D
与
Type V
‑
E
亚型的效应蛋白分别为
CasX
与
CasY
，也被称为
Cas12d
与
Cas12e
，最初在“不可培养”的微生物的宏基因组中被发现，在
2019
年也被证明其具有在大肠杆菌和人类细胞系中的基因组编辑活性
。
之前被认为是
Type V
‑
U
家族的亚型之一的
Type V
‑
F
亚型的效应蛋白为
Cas14(
也被称为
Cas12f)
，可以切割单链
DNA
与
RNA
，这种大小仅为
Cas9
蛋白三分之一的
Cas14
蛋白首先被开发成了核酸检测工具
DETECTOR
，近期也被证明其有原核
、
真核生物体内
DNA
双链的切割活性
。
而近期在巨噬菌体中发现的
Cas
φ
蛋白
(
又称
Cas12j)
也被证明在原核
、
动物细胞与植物细胞中均具有
DNA
双链的切割能力
。
在
Type V
‑
K
类型中，其效应蛋白
Cas12k
被转座子
Tn7
所“劫持”，在靶位点处可以产生
R
‑
环，并利用
crRNA
的靶向能力，实现转座子的定点转座
。
这种劫持蛋白提供了一个新的靶向插入
DNA
的策略
。
[0005]鉴定新的能够实现基因编辑功能的
CRISPR
效应蛋白，能够丰富基因组编辑工具，对于生物医药领域具有重要意义
。
[0006]专利技术简述
[0007]本专利技术至少提供以下技术方案：
[0008]实施方案
1.
一种工程化的规律间隔成簇短回文重复序列
(CRISPR)
系统，包含：
[0009]a)
转座子和
CRISPR
‑
Cas12
中间体
(TraC)
效应蛋白或者编码该效应蛋白的一种或多种核苷酸序列；和
[0010]b)
一种或多种向导
RNA
，或者编码该一种或多种向导
RNA
的核苷酸序列，
[0011]其中向导
RNA
选自
i)
衍生自转座子右端元件的向导
RNA(reRNA)
和
/
或
ii)
包含
tracrRNA
和
/
或
crRNA
的向导
RNA
，例如包含
tracrRNA
和
crRNA
的单向导
RNA(sgRNA)
；
[0012]所述
TraC
效应蛋白能够与向导
RNA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种工程化的规律间隔成簇短回文重复序列
(CRISPR)
系统，包含：
a)
转座子和
CRISPR
‑
Cas12
中间体
(TraC)
效应蛋白或者编码该效应蛋白的一种或多种核苷酸序列；和
b)
一种或多种向导
RNA
，或者编码该一种或多种向导
RNA
的核苷酸序列，其中向导
RNA
选自
i)
衍生自转座子右端元件的向导
RNA(reRNA)
和
/
或
ii)
包含
tracrRNA
和
/
或
crRNA
的向导
RNA
，例如包含
tracrRNA
和
crRNA
的单向导
RNA(sgRNA)
；所述
TraC
效应蛋白能够与向导
RNA
形成
CRISPR
复合物；所述
TraC
效应蛋白既能够在衍生自转座子右端元件的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列，也能够在包含
tracrRNA
和
/
或
crRNA
的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列
。2.
根据权利要求1所述的工程化的
CRISPR
系统，其中所述
tracrRNA
含有与非靶向链
(NTS)
互补配对的非靶向链结合序列
(NTB)。3.
一种包含一种或多种构建体的工程化的规律间隔成簇短回文重复序列
CRISPR
载体系统，包含：
a)
可操作地连接至编码转座子和
CRISPR
‑
Cas12
中间体
(TraC)
效应蛋白的核苷酸序列的第一调节元件；和
b)
可操作地连接至一种或多种核苷酸序列的第二调节元件，该一种或多种核苷酸序列编码一种或多种向导
RNA
，该向导
RNA
选自
i)
衍生自转座子右端元件的向导
RNA(reRNA)
和
/
或
ii)
包含
tracrRNA
和
/
或
crRNA
的向导
RNA
，例如包含
tracrRNA
和
crRNA
的单向导
RNA(sgRNA)
；所述
TraC
效应蛋白能够与向导
RNA
形成
CRISPR
复合物；所述
TraC
效应蛋白既能够在衍生自转座子右端元件的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列，也能够在包含
tracrRNA
和
/
或
crRNA
的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列
。4.
根据权利要求3所述的工程化的
CRISPR
载体系统，其中所述
tracrRNA
含有与非靶向链
(NTS)
互补配对的非靶向链结合序列
(NTB)。5.
如权利要求2或4所述的系统，其中向导
RNA
为包含
tracrRNA
和
crRNA
的向导
RNA
，其中所述
tracrRNA
含有与非靶向链
(NTS)
互补配对的非靶向链结合序列
(NTB)
，其中所述向导
RNA
通过
crRNA
与目标
DNA
序列的靶向链
(TS)
杂交，并且通过
NTB
与非靶向链
(NTS)
杂交
。6.
如权利要求4所述的系统，其中当转录时，该一种或多种向导
RNA
与目标
DNA
杂交，并且向导
RNA
与该
TraC
效应蛋白形成复合物，该复合物引起该目标
DNA
序列远端切割
。7.
如权利要求1‑6中任一项所述的系统，其中该目标
DNA
序列是在细胞内，优选为真核细胞内
。8.
如权利要求1‑7中任一项所述的系统，其中该效应蛋白包含一个或多个核定位序列
(NLS)、
细胞质定位序列
、
叶绿体定位序列或线粒体定位序列
。9.
如权利要求1‑8中任一项所述的系统，其中编码该效应蛋白的这些核酸序列被密码子优化，用于在真核细胞中表达
。10.
如权利要求1‑9中任一项所述的系统，其中组分
a)
和
b)
或它们的核苷酸序列构建在相同或不同载体上
。11.
一种修饰目的
DNA
序列的方法，该方法包括将如权利要求1‑
10
中任一项所述的系统地送到所述目的
DNA
序列或含有该目的
DNA
序列的细胞中
。
12.
一种修饰目的
DNA
序列的方法，该方法包括将
TraC
效应蛋白和一种或多种核酸组分的组合物递送至所述目的
DNA
序列，其中所述效应蛋白既能够在衍生自转座子右端元件的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列，也能够在包含
tracrRNA
和
crRNA
的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列；该效应蛋白与该一种或多种核酸组分形成
CRISPR
复合物，并且在所述复合物与是前间区序列邻近基序
(PAM)
的3’
的目的
DNA
序列靶向结合后，该效应蛋白诱导对该目的
DNA
序列的修饰
。13.
如权利要求
12
所述的方法，其中该目的基因是在细胞内，优选为真核细胞
。14.
如权利要求
13
所述的方法，其中该细胞是动物细胞或人类细胞
。15.
如权利要求
13
所述的方法，其中该细胞是植物细胞
。16.
如权利要求
12
所述的方法，其中该效应蛋白包含一个或多个核定位序列
(NLS)、
细胞质定位序列
、
叶绿体定位序列或线粒体定位序列
。17.
如权利要求
12
所述的方法，其中效应蛋白和核酸组分，或表达所述效应蛋白和核酸组分的构建体被包含在一个递送系统中
。18.
如权利要求
17
所述的方法，其中递送系统包括病毒
、
病毒样颗粒
、
病毒体
、
脂质体
、
囊泡
、
外来体
、
脂质体纳米颗粒
(LNP)、N
‑
乙酰半乳糖胺
(GalNAc)
或工程菌
。19.
一种用于在生物体或生物体细胞中进行基因组编辑的转座子与
CRISPR
‑
Cas12
中间体
(TraC)
效应蛋白或其功能性变体，其中所述
TraC
效应蛋白或其功能性变体能够与向导
RNA
形成
CRISPR
复合物；所述向导
RNA
选自
i)
衍生自转座子右端元件的向导
RNA(reRNA)
和
/
或
ii)
包含
tracrRNA
和
crRNA
的向导
RNA
，例如包含
tracrRNA
和
crRNA
的单向导
RNA(sgRNA)
；所述
TraC
效应蛋白或其功能性变体既能够在衍生自转座子右端元件的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列，也能够在包含
tracrRNA
和
crRNA
的向导
RNA
的引导下靶向结合目标
DNA
序列
。20.
用于在生物体或生物体细胞中进行基因组编辑的转座子与
CRISPR
‑
Cas12
中间蛋白
(TraC)
效应蛋白或其功能性变体，所述
TraC
效应蛋白或其功能性变体
(i)
包含选自“TSxxCxxCx”、“GIDRG”和“CxxCGxxxxADxxAA”的至少一个
、
至少两个或全部三个氨基酸序列基序，其中
x
代表任意氨基酸，例如任意天然编码的氨基酸；和
(ii)
包含与
SEQ ID NO:1
‑
37
之一具有至少
30
％
、
至少
35
％
、
至少
40
％
、
至少
45
％
、
至少
50
％
、
至少
55
％
、
至少
60
％
、
至少
65
％
、
至少
70
％
、
至少
75
％
、
至少
80
％
、
至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％
、
至少
99
％
、
至少
99.1
％
、
至少
99.2
％
、
至少
99.3
％
、
至少
99.4
％
、
至少
99.5
％
、
至少
99.6
％
、
至少
99.7
％
、
至少
99.8
％
、
至少
99.9
％
、
甚至
100
％序列相同性的氨基酸序列，或包含相对于
SEQ ID NO:1
‑
37
具有一或多个，例如1个
、2
个
、3
个
、4
个
、5
个
、6
个
、7
个
、8
个
、9
个或
10
个氨基酸取代
、
缺失或添加的氨基酸序列
。21.
权利要求
20
所述的
TraC
效应蛋白或其功能性变体，其中所述效应蛋白功能性变体衍生自
SEQ ID NO:25
，且相对于
SEQ ID NO:25
序列包含选自
K78R、D86R、S137R、V145R、I147R、P148R、D150R、V228R、V254R、A510R、A278R、K315R、S334R、L343R、A369R、H392R、L394R、S408R、N456R、V500R、A510R、T573R
的一个或多个氨基酸取代
。22.
权利要求
20
或
21
所述的
TraC
效应蛋白或其功能性变体，其中所述效应蛋白功能性变体衍生自
SEQ ID NO:25
，且相对于
SEQ ID NO:25
序列包含选自表3或表4中所示的任一组
突变
。23.
权利要求
20
所述的
TraC
效应蛋白或其功能性变体，其中所述效应蛋白功能性变体包含选自
SEQ ID NO:80
‑
87
的氨基酸序列
。24.
权利要求
20
‑
23
中任一项的
TraC
效应蛋白或其功能性变体，其至少具有向导
RNA
介...

【专利技术属性】
技术研发人员：高彩霞，靳帅，朱子旭，李运嘉，K，
申请(专利权)人：北京齐禾生科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：